바이오필름 형성 중 실시간 영상 및 압력 추적을 위한 마이크로유체 장치

초록

출처: Kurz, D. L. 외 다공성 매질에서 생체 클로깅을 연구하기 위한 마이크로플루이딕 플랫폼. J. Vis. 경험 (2022)

이 영상은 바이오필름 형성을 연구하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 박테리아 현탁액이 마이크로채널에 주입된 후 바이오필름 현상을 위해 배양합니다. 그 후 유동을 재개하고, 압력 모니터링과 영상을 사용하여 시간에 따른 바이오필름 형성과 기공 폐쇄를 감지합니다.

프로토콜

1. 실리콘 웨이퍼 준비

1. 컴퓨터 지원 설계(CAD; 재료표 참조) 소프트웨어에서 마이크로플루이딕 채널의 형상을 설계하여 투명 필름에 인쇄하여 포토마스크를 만듭니다(그림 1A).
2. 아래 단계에 따라 클린룸 조건에서 소프트 리소그래피로 마스터 몰드를 제작합니다.
   1. 실리콘 웨이퍼를 200 °C에서 2시간 동안 베이킹하세요.
   2. 웨이퍼를 스핀 코터 중앙에 놓고 SU8 3050 포토레지스트( 재료표 참조)를 웨이퍼 위에 부어줍니다. 1,700rpm에서 40초간 스핀 코팅을 하고, 10s/100rpm 램프 타임을 가동합니다.
      참고: 스핀 코팅 매개변수는 SU8 3050의 목표 두께 100 μm를 달성하도록 설정되었습니다.
   3. 스핀 코팅 과정 후, 실리콘 웨이퍼를 65°C에서 600초, 95°C에서 2,700초간 소프트베이킹합니다. 웨이퍼를 실온에서 하룻밤 식히세요.
      참고: 야간 냉각은 SU8이 웨이퍼에 접착력을 높여줍니다.
   4. 포토마스크(단계 1.1)를 웨이퍼에 부착하고 250 mJ/cm²의 노출 에너지와 350 nm 파장으로 자외선에 노출합니다.
   5. 노출 후에는 노출된 기판을 65°C에서 60초, 95°C에서 300초를 구워둡니다.
   6. 실리콘 웨이퍼를 mrDev600 현상액이 채워진 비커에 담가서 마스터 몰드를 얻으려면 실리콘 웨이퍼를 현상합니다( 재료표 참조). 비커를 1,800초 동안 부드럽게 흔들어 중합되지 않은 레지스트를 씻어내세요. 그 다음 실리콘 웨이퍼에 이소프로판올을 뿌려 스플래시 워시를 하고 자연 건조하세요.
   7. 실리콘 웨이퍼를 200 °C에서 1,800초간 강하게 베이킹합니다.
3. 마스터 몰드를 실란화하여 20 μL 트리클로로(1H, 1H, 2H-퍼플루오록틸) 실란 (재료표 참조)을 진공 건조기 유리 슬라이드에 40분간 놓아 100 mbar의 압력을 만듭니다.

2. 마이크로플루이딕 장치 제작

참고: 여기서 설명하는 제조 절차는 하나의 마이크로플루이딕 채널을 가진 마이크로플루딕 장치에 대한 것입니다. 하지만 동일한 방법을 여러 개의 마이크로플루이딕 채널이 병렬로 작동하는 마이크로플루이딕 장치를 제작하는 데도 적용할 수 있습니다.

1. 엘라스토머와 가교 결합체를 10:1 비율로 혼합하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 혼합물을 만듭니다. 혼합물을 균일하게 섞고 폐쇄된 공기 방울로 인해 불투명해질 때까지 저어주세요.
2. 진공 건조기에서 혼합물을 탈기하여 100 mbar의 게이지 압력을 만들어 갇힌 기포가 제거되고 투명해 보일 때까지 유지합니다. 탈기에 소요되는 시간은 보통 30분입니다.
3. 마스터 몰드(1단계)를 세포 배양 접시에 배치합니다( 재료표 참조). 마스터 몰드에 PDMS 혼합물 20g을 부어 최종 두께 5mm의 채널을 만듭니다.
4. 마스터 몰드를 70°C에서 2시간 동안 구워요.
5. 경화된 PDMS를 약 3mm 거리에서 칼날로 절단한 후, PDMS 마이크로플루딕 채널을 마스터 몰드에서 떼어냅니다.
6. 마이크로유체 채널의 입구와 출구를 만들기 위해, 생검 펀치(직경 1.5mm)로 그 끝부분(삼각형 상단, 그림 1A 참조)에 구멍을 뚫어야 합니다. 나중에 압력 센서를 설치할 수 있도록 입구 삼각형 중앙에 구멍을 하나 더 뚫으세요.
7. 유리 슬라이드와 마이크로플루이딕 채널을 시판용 1% 세제 용액( 재료표 참조)으로 5분간 세척한 후 탈이온수로 헹구세요. 그 후 PDMS 마이크로플루이딕 채널과 유리 슬라이드를 이소프로판올로 세척하세요. 그 후 다시 탈이온수로 세척하세요. PDMS 마이크로플루이딕 채널과 유리 슬라이드를 1바 압력으로 1분간 압축 공기로 건조하세요.
   참고: 결합이 효과를 발휘하려면 PDMS의 다공성 구조가 완전히 건조되어야 합니다.
8. 유리 슬라이드와 마이크로플루이딕 채널을 플라즈마 클리너에 넣고( 재료표 참조), 접합할 표면이 위를 향하도록 하세요. 플라즈마 클리너를 켜고 미세유체 채널과 유리 슬라이드를 1분 동안 1 SL/h(표준 리터/시간) 공기 흐름으로 공기 플라즈마로 처리하세요. 세척기에서 꺼낸 직후 유리 슬라이드를 서로 접촉시켜 마이크로플루이딕 채널을 바로 접합하세요.
   참고: 처리된 표면을 만지지 않도록 주의하세요. 접착에 영향을 줄 수 있습니다. 여러 개의 마이크로플루이딕 채널을 가진 마이크로플루이딕 장치를 제작할 때는 마이크로플루이딕 채널을 동시에 노출시키고 한 단계로 결합하세요.
9. 접착된 마이크로플루이딕 장치를 80°C 핫플레이트 위에 최소 15분간 올려놓으세요.
10. 실험이 시작될 때까지 마이크로플루이딕 장치를 깨끗한 세포 배양 접시에 보관하세요.

3. 박테리아 현탁액 준비

1. 실험 시작 20시간 전, 15mL 배양관 내 냉동 글리세롤 스톡에서 영양 육수 No. 3 배양 배양액(재료표 참조)을 직접 접종하여 Bacillus subtilis NCIB 3610 집단을 키웁니다. 진동 인큐베이터에서 30°C, 200rpm에서 하룻밤(16시간) 배양합니다.
2. 실험 시작 4시간 전, 15mL 배양관 3mL의 신선 배양지(1:1,000 희석)에 3μL을 추가하여 하룻밤 배양에서 아브배양을 만듭니다. 서브컬처를 30°C, 200rpm에서 진동 인큐베이터에서 3.5-4시간 배양하여 600 nm(OD₆₀₀)에서 0.1의 광학 밀도를 얻습니다.

4. 바이오필름 성장 실험

1. 실험 3시간 전에 현미경의 박스 인큐베이터를 켜어 25 °C의 안정적인 온도를 유지하세요. 주사기 펌프와 압력 센서를 장착하세요( 재료표 참조).
2. 입구와 출구 튜빙을 마이크로플루이딕 장치에 연결하세요. 튜브와 주사기 사이의 연결을 고정하기 위해 외부 직경 0.6mm의 바늘을 직접 유입 튜브에 삽입하세요.
3. 마이크로유체 장치, 30mL의 탈이온수, 30mL의 배양지를 진공 건조기에 넣고 최소 1시간 동안 탈기합니다. 그 후 배양 배지와 탈이온수를 천천히 두 개의 30mL 주사기로 분리해 모으세요.
   참고: 이 단계는 배양 배지와 함께 세척할 때 채널 내 기포 형성을 방지하는 데 매우 중요합니다.
4. 마이크로플루이딕 장치를 현미경에 장착하고 배출 튜브를 폐기통에 넣으세요.
   1. 탈이온화된 물이 채워진 주사기를 마이크로플루딕 채널에 연결하고, 압력 센서 출구에서 물이 나올 때까지 천천히 주입합니다. 압력 센서에 물을 채우고 마이크로플루이딕 채널과 압력 센서를 연결하는 튜빙에서 나오는 모든 기포를 씻어내세요. 압력 센서 전용 나사로 압력 센서 출구를 닫으세요.
      참고: 설명된 충전 절차는 마이크로유체 채널 입구의 압력 변화를 정확히 기록하도록 보장합니다. 여러 개의 마이크로유체 채널을 사용하는 실험을 수행할 때는 각 채널을 별도의 주사기에 연결하여 모든 채널의 흐름 조건이 균등하도록 합니다.
5. 나머지 마이크로유체 채널을 탈이온수로 채우세요.
6. 배양 배지 주사기에 1.2 μm 필터( 재료표 참조)를 올려놓습니다. 그 후 물 주사기를 제거하고 배양 배지 주사기를 흡입구 마이크로유체 튜빙에 조심스럽게 연결하세요. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 배양 배지를 2 mL/h 유량으로 1시간 동안 세척합니다.
   참고: 필터는 주사기 장전 중 박테리아 세포가 주사기에 들어오는 것을 막습니다. 마이크로플루이딕 채널을 배양 매체로 세척하면 다공성 구조 내 남은 기포를 제거할 수 있습니다.
7. 실험 중 원하는 유량(여기서는 1 mL/h)으로 주사기 펌프를 설정하고, 압력 센서의 압력 측정값은 0으로 설정하세요.
   참고: 초기 압력 측정을 0으로 설정하면 실험 중 바이오필름 현상으로 인한 압력 차이만 측정됩니다.
8. 박테리아 배양 1mL를 OD₆₀₀ 0.1로 피펫팅하여 1.5mL 원심분리기 바이알에 넣습니다. 출구 튜브를 원심분리기 바이알에 넣어 박테리아 배양물을 마이크로 유체 채널에 주입하세요. 튜브 출구에서 잠재적인 기포를 제거하기 위해 5분간 기다린 후, 1 mL/h 유속으로 150 μL 박테리아 용액을 추출하여 미세유체 채널에 박테리아 배양물이 가득 찰 때까지 투여합니다.
9. 배양 배지 주사기 필터를 조심스럽게 제거하고 배출구를 폐기통에 넣으세요. 박테리아 세포를 마이크로유체 채널에서 3시간 동안 무유동 상태로 두어 다공성 매질에 표면이 부착될 수 있도록 하세요.
   참고: 박테리아 세포를 3시간 동안 무유동 상태로 두는 것은 박테리아 균주가 잘 부착되도록 최적화되었으며, 박테리아 배양이 잘 산소화된 배양을 보장했습니다. 다른 박테리아 균주는 더 많은 시간이 걸릴 수도 있고 더 짧을 수도 있습니다.
10. 실험을 시작하려면, 주사기 펌프를 원하는 유량(여기서는 1 mL/h)으로 설정하고 1 Hz에서 압력 측정을 시작하세요.
11. 원하는 시간, 광학 구성, 배율 등으로 성장하는 바이오필름의 이미지를 획득하세요. ​
    참고: 본 연구에서는 밝은 영역 모드에서 4배 배율로 18개 위치에서 다공성 매질 전체 영역을 6분마다 24시간 동안 촬영했습니다.

결과

그림 1: 마이크로플루딕 채널 설계 및 실험 설정. (A) 다양한 기공 크기(75 μm, 150 μm, 300 μm)를 가진 마이크로플루이딕 채널의 포토마스크를 다공성 매체 아날로그로 사용하고, 기둥 배열을 확대하여 촬영한 사진(하단 행). 원은 기둥(불투수성 장애물)의 위치를 나타내며, 이는 다공성 매질의 고체 상태를 나타냅니다. (B) 주사기, 압력 센서, 단일...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아크로디스크 25mm 주사기 필터, 1.2 μm 베르사퍼 멤브레인	팔 코퍼레이션	PN4190	1.2 μm 필터
BD 10 mL 주사기 (루어-락)	BD	300912	수로를 이온수 채우는 데 사용됨
박스 인큐베이터	생명 영상 서비스		바이오필름 성장 실험 중 온도가 안정적이었기 때문입니다
셀 밀도계 CO8000	WPA 바이오웨이브		외측계
원심분리기 바이알	에펜도르프	30120086	1.5 mL
세토니 베이스 120	세토니 GmbH		주사기 펌프
코렐캐드	코렐드로		마이크로플루이딕 채널 기하학 설계에 사용된 소프트웨어
배양관 (14mL, 멸균)	그레이너 바이오-원		배양관
건조 오븐, VENTI-Line	VWR		PDMS 경화를 위한 오븐
편리하네요	미그로스		세제 용액
온도 조절이 가능한 핫플레이트	VRW		플라즈마 처리 후 PDMS-유리 결합을 경화하기 위해
이노바 42 Inc 셰이커 (뉴브런즈윅)	에펜도르프		인큐베이터
이소프로판올 (> 99.8%)	시그마 올드리치	67-63-0
마스터플렉스 트랜스퍼 튜빙	마스터플렉스	HV-06419-05	0.020인치 내경, 0.06인치 외경
마이크로 슬라이드, 평면, 75 x 60 mm	코닝	2947-75X50	유리 슬라이드
마이크로플루딕 압력 센서 (1 bar)	엘브플로우		압력 센서
밀텍스 생검 펀처, 직경 1.5mm	인테그라		마이크로유체 채널의 입구와 출구 구멍을 뚫기 위한 펀처
mrDev600 개발자	마이크로레지스트
니콘 이클립스 Ti2	니콘 인스트루먼트		현미경
영양 육수 3번	시그마 올드리치
루어락이 장착된 옴니픽스 주사기	B. 브라운		다양한 용량의 주사기
플라즈마 챔버 제프토	디너 일렉트로닉	제토-1	PDMS와 유리 슬라이드를 플라즈마 결합하는 데 사용됩니다
정밀 와이프 (킴텍 사이언스)	킴벌리 클라크	KCP-7552	유리 슬라이드를 건조시키기 위해
규모	VWR-CH	611-2605	엘라스토머와 가교결합 작용제의 비율을 측정하는 데 사용됨
실리콘 웨이퍼 (10cm)	실리콘 머티리티얼 주식회사		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
스핀코터, 스핀 모듈 SM150	사와텍
SU8 3050 포토레지스트	카야쿠암
Süss MA6 마스크 정렬기	SUSS 마이크로텍 그룹		크롬 글라스 마스크를 정렬하는 데 사용됨
실가르드 184	다우 코닝		실리콘 엘라스토머 키트; 경화제
테크니 에치 CR01	기술		기술
조직 배양 접시 150	TPP	93150
트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H 퍼플루오로옥틸) 실란	시그마 올드리치	시그마 올드리치	실리카인 웨이퍼의 실란화에 사용됨
Veeco Dektak 6 M	비코		프로파일로미터