식물 뿌리 표면에 대한 박테리아 부착의 현미경 기반 평가

Abstract

출처: Matthysse, A. G. 실험실에서 측정한 박테리아의 식물 표면 부착 현상. J. Vis. 경험 (2018).

이 영상은 위상 차이 현미경을 이용해 박테리아가 식물 뿌리에 부착하는 상태를 평가하는 과정을 보여줍니다. 박테리아와 함께 배양된 묘목의 뿌리 샘플을 먼저 마운트하여 자유 박테리아를 확인합니다. 샘플은 느슨하게 붙어 있는 박테리아를 제거하기 위해 세척한 후, 손상을 방지하기 위해 적절한 커버슬립을 사용해 다시 장착합니다. 마지막으로, 뿌리털에 부착된 박테리아의 수를 현미경으로 세어봅니다.

Protocol

1. 박테리아 예방접종

1. 박테리아 부착 측정과 배양 시간을 측정하는 기준으로 접종할 박테리아 수를 결정합니다.
2. 1일 미만의 잠복 시간을 포함하는 현미경 연구에서는 비교적 많은 수의 박테리아를 접종합니다. 최종 박테리아 농도가 10⁶ mL 이상으로 되도록 배양물을 추가하세요. 더 긴 배양 시간을 위해서는 박테리아 접종 크기를 줄이세요.
3. 박테리아 부착력을 생존 가능한 세포 수로 측정하는 연구의 경우, 최종 박테리아 농도가 10³ 에서 10⁶ mL당 되도록 배양을 추가합니다.
4. 배양 배양지의 pH나 산소 농도가 대사에 영향을 줄 만큼 박테리아를 너무 많이 추가하지 마세요. pH 종이나 전극을 사용해 측정하세요. 산소 전극을 사용해 산소 농도를 측정하세요.
5. 모래에서 자란 식물의 경우, 세 가지 가능한 방법으로 접종하세요.
   1. 심기 전에 씨앗을 약^10-6 mL 크기의 물에 1분간 담가서 박테리아를 접종하세요.
   2. 발아시키는 축제 묘목으로 뿌리에 접종을 하세요. 묘목 뿌리가 약 1cm 길이가 되면 뿌리를 담가거나 전체 묘목을 10-6 박테리아 10/mL 부탁액에 1분간 물에 담가세요.
   3. 심기 전에 모래와 박테리아를 섞어 최종 농도가 약 10.3 박테리아/mL 정도로 되도록 예방 접종하거나, 심은 후 10-6 박테리아의 현탁액으로 물을 주어 모래에 접종하세요.

2. 박테리아와 식물 재료의 배양

1. 액체 배지를 배양할 때는 박테리아와 식물 물질을 멸균수, 자당 및 광물염 또는 식물 조직 배양 배지(예: 무라시게 및 스쿠그 기저염 혼합물의 1:10 희석 또는 MS 염)에서 배양하세요.
   1. 박테리아가 달라붙지 않는 용기를 사용하세요. 식물 표면을 지속적으로 덮어두도록 노력하세요. 물에 담그거나 부드러운 저어주기로 하세요. 격렬한 교반은 식물 표면의 접착을 방해하거나 박테리아를 제거할 수 있습니다.
   2. 다양한 시간 간격 후에 식물 물질을 광학 현미경으로 관찰하여 언제 부화를 중단하고 측정할지 결정하세요. 접착 시간 주기는 상호작용 속도에 따라 1시간에서 4시간마다, 또는 매일 샘플을 채취하는 경우가 많아 매우 유용합니다.
2. 모래에서 배양할 때는 2.1단계에서 설명한 액체 배양에 대해 설명한 동일한 고려사항을 적용하세요.

3. 현미경을 이용한 접착력 측정

1. 표면의 박테리아를 쉽게 관찰하기 위해 노마스키 광학이나 위상 대비 광학 장비를 사용해 현미경으로 측정하세요. 하지만 20배 이상의 배율을 가진 밝야 현미경은 모두 사용할 수 있습니다.
   1. 현미경 관찰을 통해 박테리아가 무작위로 분포하는지 특정 부위에 분포하는지 확인하세요. 또한 단독으로 묶여 있는지, 아니면 군집으로 묶여 있는지도 확인하세요. 유착 후 박테리아 성장이나 갇힘 가능성을 시사하는 미세한 콜로니가 있는지 확인하세요. 박테리아가 표면에 바이오필름을 형성하는지 확인하세요.
      참고: 바이오필름은 표면에 결합된 다수의 박테리아를 세포외 기질로 둘러싸고 있는 형태입니다. 구조는 매끄럽고 균일할 수도 있고, 더 복잡한 구조를 가질 수도 있습니다.
   2. 형광 마커가 부착된 박테리아를 사용하세요. 다른 박테리아가 존재하고 관심 박테리아가 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 태그로 식별된다면, 형광 현미경을 사용해 태그된 박테리아가 다른 박테리아 군집 내에 있는지 확인합니다. GFP는 490nm 여기와 520nm 방출을 가진 필터를 사용하세요.
      1. 형광 태그가 박테리아에 부정적인 영향을 미치지 않는지 확인하라. 노마르스키 광학과 형광 광학 모두를 사용해 야생형 박테리아와 태그된 박테리아가 동등하게 섞인 액세닉 물질에 부착하는 모습을 관찰한다. 형광 박테리아와 어두운 박테리아가 무작위로 혼합되어 같은 수로 존재한다면, 태그는 분석에 방해가 되지 않았습니다.
2. 부착된 박테리아의 수를 측정하세요.
   참고: 현미경에서 부착된 박테리아의 수를 결정하는 것은 매우 어렵습니다. 결합이 불규칙한 식물 표면에 있을 때는 일반적으로 정량적인 측정을 얻기 어렵습니다. 주사 전자현미경(이 글에서는 다루지 않음)을 사용하여 이러한 측정을 할 수 있습니다.
   1. 박테리아가 뿌리털과 같은 매끄러운 표면에 결합되었을 때, 뿌리털 길이 mm당 뿌리털 가장자리에 결합된 박테리아 수를 세어보세요. 측정 비교할 때 크기와 모양이 비슷한 뿌리털을 꼭 사용하세요.
   2. 현미경에서 물체의 크기를 측정하려면 측정된 표시가 있는 상업용 슬라이드를 사용하세요. 이 슬라이드를 실험 재료와 동일한 설정으로 관찰하고 촬영한 후, 결과된 이미지를 바탕으로 현미경 촬영 대상의 크기를 결정합니다.
3. 현미경 검사를 위해 샘플을 준비하세요.
   1. 샘플을 씻어. 샘플을 현미경 슬라이드의 물방울이나 배양 배양지에 옮겨 직접 관찰하세요.
      참고: 이 방법은 박테리아 증식이나 실제 박테리아 사멸이 없으면 자유 박테리아가 많지 않을 가능성이 높다는 장점이 있습니다. 자유 박테리아가 없다는 것은 박테리아 사사나 배양 용기에 박테리아 결합이 있었을 가능성을 경고 신호로 삼으세요. 샘플을 세척하는 효과는 그림 1에 나타난다.
   2. 샘플을 액체 바이알에 넣고 부드럽게 뒤집어 물이나 배양 매체에 부드럽게 세척하세요. 그 후 샘플을 현미경 슬라이드에 신선한 액체에 담근 상태로 놓아 관찰합니다.
   3. 일반 커버 슬립과 현미경 슬라이드를 사용해 샘플을 액체에 장착합니다.
      1. 샘플이 두꺼워서 커버 슬립 아래에 부풀어 오를 수 있다면, 프레스-적용 커버 슬립을 사용하세요. 이 커버 슬립은 가장자리에 고무나 플라스틱 고리가 있습니다. 액체와 샘플을 뚜껑 슬립에 넣고 슬라이드를 위에 올려놓고 부드럽게 눌러 덮개 슬립을 슬라이드에 밀봉하세요. 뒤집어 살펴보세요.
      2. 또는 조류 수 측정 슬라이드와 덮개 슬립을 비슷한 방식으로 사용할 수 있습니다. 이 깊이의 슬라이드는 일반적으로 20배 이상의 대물렌즈로 검사할 수 없다는 점에 유의하세요.

Results

그림 1: 결합된 박테리아 수를 결정하기 위한 샘플 준비 단계. 아그로박테리움 투메파시엔스 는 토마토 뿌리털(A, B, C)과 나일론 실(D, E, F)에 결합합니다. 세척하지 않고 물에 장착한 샘플에서는 결합된 박테리아(검은 화살표)와 자유 박테리아(흰 화살표)가 모두 관찰됩니다(A와 D). 세척 후에는 결합된 박테리아는 남아 있지만, 자유 박테리아는 더 이상 존재하지 않습니다(B와 E). 초음파 처리 후에는 결...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
광학 현미경	어떤	해당 없음	위상 대비나 노마르스키 광학이 도움이 되며, 형광 마커를 사용하는 연구에는 형광 현미경이 필요합니다.
씨앗	어떤	해당 없음	씨앗 로트 번호와 품종을 기록하세요
표백제	어떤	해당 없음
배스 소닉 케이터	과학 용품 회사	해당 없음
트리톤 X-100	시그마-올드리치	T9284
영양 한천	디프코	2001-01-08
대두석	디프코	24360
모래	바다 모래 피셔 사이언티브	S25
모래	시그마-올드리치	S9887
컨테이너	스튜우 앤 선즈 주식회사	레이-리치 원뿔-테이너	키우고자 하는 식물 종류에 맞는 다양한 크기의 제품이 있습니다
파라필름	과학 용품 회사	해당 없음
MS 염	시그마-올드리치	M5524
세지윅-서까래 계수 셀	하우저 사이언티브	HS3800
프로브 클립 프레스 씰 인큐베이틴 챔버	시그마-올드리치	Z359483
리팜피신	시그마-올드리치	R3501