암성 상피세포의 시겔라 감염 중 스트레스 과립 형성

초록

출처: Vonaesch, P. 외, 포유류 세포의 박테리아 도전 후 스트레스 과립 형성의 면역형광 분석. J. Vis. 경험 (2017)

이 영상은 병원성 박테리아인 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri )에 의해 상피세포가 감염되고 그로 인한 숙주 세포 반응을 보여줍니다. 박테리아 효과 단백질은 숙주 번역을 방해하여 세포의 적응 반응인 스트레스 과립이라 불리는 막 없는 소기관 형성을 촉진합니다.

프로토콜

1. 박테리아 및 숙주 세포의 준비

1. 12mm 또는 14mm 유리 커버 슬립을 각각 24웰 또는 12웰 플레이트에 무균 핀셋으로 옮기며, 실험 조건당 한 개의 웰을 계산합니다. 이 제품을 조직 배양 후드에서 자외선(UV) 처리로 15분간 멸균합니다.
   참고: 박테리아 도전과 외부 스트레스에 의한 응력 과립(SG) 유도를 위한 대조 우물을 포함합니다.
2. 24웰 플레이트에 12mm 커버슬립을 사용할 경우, 커버슬립 위에 1 x 10 5^{개의 포유} 류 세포(예: HeLa 세포)를 시딩합니다; 멸균 피펫 팁으로 커버를 눌러 누르세요. 세포는 각 세포 유형에 적합한 배양지에서 37°C에서 5%_CO2 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 접착하게 합니다.
   참고: 다음 날 세포 합류율이 40%에서 60% 사이에 되도록 세포를 배지합니다.
   1. HeLa 세포의 경우, Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM)에 비필수 아미노산(NEAA)과 10% 상보전화된 태아 송아지 혈청(FCS)을 함께 배양합니다. FCS는 56°C 물욕에서 30분간 가열한 후 15분 후 한 번 혈청을 휘저어 탈보완합니다.
3. 박테리아를 줄무늬로 제거하려면, 멸균 피펫 팁을 사용해 -80°C 냉동고에 보관된 박테리아 글리세롤 스톡(20% 글리세롤)에서 소량을 제거해 라벨이 붙은 플레이트에 올려놓으세요. 멸균 루프를 사용해 박테리아를 플레이트의 약 10% 전체에 퍼뜨리세요. 새 멸균 루프를 사용해 도말 부위에 드래그해서 반 플레이트 길이의 평행선 3개를 만드세요. 이 선들을 따라 줄을 그려 나머지 판을 덮어. 플레이트를 O/N을 37 °C에서 배양합니다.
   1. 갓 줄무늬 표시한 플레이트에서 단일 박테리아 군락(예: 시겔라 플렉스네리)을 선택하세요. 1주일 이상 된 박테리아 집락은 피하세요.
   2. S. flexneri 균주 M90T의 경우, 갓 줄무늬 제거한 트립틱 대두 한가-0.1% 콩고 적색 한천 플레이트에서 적색 콜로니를 15mL 튜브에 8mL 트립틱 대두 육수에 접종합니다; 뚜껑을 꽉 닫고 30°C에서 222rpm O/N에서 진동을 배양하세요. 주의: 큰 흰색 군락은 병원성 플라스미드를 잃었고 감염성이 없으므로 사용하지 마십시오.

2. 숙주 세포에 대한 박테리아 도전

1. 감염 가능성을 극대화할 수 있도록 박테리아를 준비하세요.
   1. S. flexneri의 경우, 8mL 트립산 대두 한천에 150 μL O/N 배양물을 첨가하여 박테리아를 37 °C에서 222 rpm에서 진동시켜 후기(~2시간)까지 진동시켜 병원성 유전자 발현을 유도하고 감염을 증진시킵니다.
      1. 배양액이 0.6에서 0.9 사이(600 nm에서 측정)일 때, 1mL 배양물을 1.5 mL 튜브에 옮깁니다. 펠릿 박테리아를 8,000 x g에서 2분간 투여한 후 감염 배지(DMEM with NEAA, FCS 없음)에서 OD₆₀₀ = 1에 재현탁합니다. 따라서 OD₆₀₀ 이 0.85라면 850 μL에서 재현탁합니다.
         참고: S. flexneri의 경우, OD₆₀₀ = 1에서 8mL 배양 시 8 x 10 8박테리아가 1mL당 8 x 10⁸ 박테리아가 존재합니다. 감염 중수(MOI)는 20이 적절합니다. 다른 병원체의 경우, OD₆₀₀에서 mL당 박테리아 수와 적절한 MOI를 경험적으로 결정해야 합니다.
   2. 박테리아-숙주 상호작용을 강화하기 위해 박테리아에 폴리-L-라이신(PLL)을 코팅합니다.
      참고: S. flexneri의 PLL 치료는 SG 역학에 영향을 미치지 않았습니다. 다른 병원체들은 PLL 치료에 대한 적합성을 평가해야 합니다.
      1. 박테리아를 PLL로 코팅하려면, 8,000 x g에서 1mL 박테리아 배양 1mL를 2분간 원심분리한 후, 10 μg/mL PLL에 인산염 완충 식염수(PBS)에 OD₆₀₀ = 1로 재현탁합니다.
      2. 박테리아 용액을 12웰 플레이트 내 웰 같은 작은 접시에 넣고, RT(~ 20 °C)에서 10분간 부드럽게 저으며 셰이커에서 배양합니다.
      3. 8,000 x g에서 2분간 박테리아를 먹이고, 과잉 PLL을 제거하세요. 펠릿을 1 mL PBS에 다시 현탁한 후 이 세척 과정을 두 번 반복하세요. 최종 세척 후에는 OD₆₀₀ = 1에서 감염 배지에 재현탁합니다.
         참고: 여기서 S. flexneri 의 감염 배지는 FCS가 없는 20 mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)(HEPES)을 포함한 숙주 세포 배지입니다.
2. 세포를 박테리아 도전에 대비시키세요.
   1. 포유류 HeLa 세포에서 배지를 흡입 펌프를 사용해 제거하세요. 500 μL RT HeLa 세포 배지를 첨가하여 세포를 세척하고, 소용돌이치며, 흡입 펌프를 이용해 배지를 제거한 뒤, 500 μL 상온(RT) 감염 배지(예: FCS 없는 20 mM HEPES 숙주 배지)로 교체합니다.
   2. 참고: 모든 세척 단계에서는 빠르게 작업하고 한 번에 최대 4개의 커버슬립만 처리하여 세포가 건조해지지 않도록 하세요.
3. 챌린지는 세포의 20-50%를 감염시키도록 박테리아로 HeLa 세포를 준비했습니다.
   참고: 각 박테리아 종별로 적절한 시기와 MOI를 결정해야 합니다. 일반적으로 좋은 시작은 37°C에서 30분, MOI는 10입니다.
   1. S. flexneri의 경우, 두 가지 방법 중 하나(2.3.1.1 또는 2.3.1.2)를 사용해 HeLa 세포에 도전하세요.
      1. PLL 처리되지 않은 박테리아(20 μL OD₆₀₀ = 24웰 플레이트 1/웰, 500 μL 배지)를 세포 위에 13000 x g에서 10분간 스핀합니다.
      2. PLL 코팅 박테리아(15 μL OD₆₀₀ = 24웰 플레이트 1/웰, 500 μL 배지)를 RT에서 15분간 추가하여 박테리아가 세포에 정착할 수 있도록 합니다.
   2. 침착한 박테리아가 있는 세포를 37°C 조직 배양 인큐베이터에 30분간 넣어 감염이 일어나도록 하세요.
      참고: 짧은 시간 동안은 조직 배양 인큐베이터 대신 37°C 물에 플레이트를 15분간 넣어 S. flexneri 감염을 동기화합니다.
4. 세포를 세척하여 감염을 막으세요.
   1. 세포를 세척하고 과도한 박테리아를 제거하려면 흡입 펌프를 이용해 배지를 제거하고, 1mL의 신선하게 예열된 (37 °C) HeLa 배양 배양지(DMEM, 10% FCS, NEAA)를 추가하세요. 미디엄을 돌리고 꺼내 새 미디엄으로 교체하세요. 두 번 반복하고 세포에 신선한 배지를 남겨둡니다.
      1. S. flexneri 또는 기타 세포내 박테리아의 경우, HeLa 세포와 세척물이 감염된 후에는 50 μg/mL 겐타마이신이 포함된 표준 조직 배양 배양액으로 배양지를 교체하여 세포외 박테리아를 죽이고 추가 세포 침범을 방지합니다.
         참고: 세포외 박테리아를 위해 배지에 항생제를 첨가하지 마세요.
5. 조직 배양 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 박테리아와 세포를 배양합니다.
   참고: S. flexneri의 경우 감염 기간이 세포 유형에 따라 최대 6시간까지 걸릴 수 있습니다. HeLa 세포의 경우, 감염이 1.5-2시간 진행된 후 SG 형성을 유도하기 위해 외부 스트레스를 추가합니다. 카코-2 감염은 시겔라 가 세포 간 전파되는 경우, 30분에서 6시간 동안 감염한 후 외부 스트레스를 추가해야 합니다. 이 시점에서 세포는 외부 스트레스를 추가하지 않고 고정하여 박테리아 감염으로 인한 SG 형성을 평가할 수 있습니다.

3. 응력 과립 형성의 고정 및 면역형광 분석

참고: 대조군과 실험용 커버슬립을 동시에 처리하여 이후 단계에서 이미지 분석에 영향을 줄 수 있는 염색 차이를 피하세요. 대조군 샘플에는 SG 유도 치료가 있는 무감염 샘플과 SG 유도 치료가 포함된 감염 샘플과 그렇지 않은 감염 샘플이 포함됩니다.

1. 흡입 펌프를 사용해 배지를 완전히 제거하고, PBS에 0.5mL RT 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 샘플을 고정합니다. RT에서 30분간 부양하세요.
   주의: PFA는 핸들러와 환경에 해롭습니다. 핸들러를 보호하고 화학 폐기물을 처리하기 위한 적절한 조치를 취하세요.
   참고: 또는 15분간 고정한 후 -20 °C 프리콜드 메탄올로 10분간 교체하여 SG 마커의 세포질 위치를 더 잘 유지할 수 있습니다.
2. 피펫으로 PFA를 제거하고 적절한 폐기물에 폐기하세요. 커버슬립을 1mL 트리스 완충 식염수(TBS: 25 mM Tris, pH 7.3; 15 mM 염화나트륨, NaCl)로 세척합니다. 세척할 때 접시 셰이커에 부드럽게 흔들며 커버슬립을 2분간 부풀어 넣으세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시겔라 플렉스네리			요청 시 여러 실험실에서 제공 가능
트립톤 카제인 대두(TCS) 육수	BD 생명과학	211825	시겔라의 표준 배양지, 적용 - 박테리아 증식
TCS 한천	BD 생명과학	236950	시겔라의 표준 성장 한천, 적용 - 박테리아 성장
콩고 레드	SERVA 전기영동 GmbH	27215.01	병원성 플라스미드를 잃은 시겔라 구별 도구, 적용 - 박테리아 증식
폴리-L-라이신(PLL)	시그마-올드리치	P1274	감염을 증가시키는 박테리아 코팅에 유용하며, 적용 - 감염
젠타미신	시그마-올드리치	G1397	세포외 박테리아를 선택적으로 죽이지만 세포질 박테리아는 아니며, 적용 - 감염
젠장	라이프 테크놀로지	15630-056	pH 버퍼는 세포가 RT 배양 시 유용하며, 적용 - 세포 배양
둘벡코의 변형 이글 매체(DMEM)	라이프 테크놀로지	31885	HeLa 세포용 표준 배양 배양지, 적용 - 세포 배양
태아 송아지 혈청(FCS)	바이오웨스트	S1810-100	헬라 세포 배양 배지에 사용되는 5% 보충제, 적용 - 세포 배양
비필수 아미노산 (NEAA)	라이프 테크놀로지	11140	HeLa 세포 배양 배지에 사용되는 1:100 희석 비율, 적용 - 세포 배양
디메틸 설폭사이드 (DMSO)	시그마-올드리치	D2650	시약 희석제, 적용 - 세포 배양
파라포름알데히드 (PFA)	전자현미경 천막	15714	4% PFA는 세포의 표준 고정, 적용 - 고정에 사용됩니다
24웰 세포 배양 플레이트	시그마-올드리치	CLS3527	표준 조직 배양 플레이트, 적용 - 세포 배양
12mm 유리 커버슬립	뉴비트로	1001/12	면역형광 응용을 위한 세포 배양 지원, 응용 - 세포 지원
겸자	시그마-올드리치	81381	저렴하고 견고한 장착 매체로 대부분의 형광체에 잘 맞는 적용 - 장착