쥐 신장 조직에서 박테리아 집락화의 형광 영상

초록

출처: 베헤라, R. K. 외. 감염된 조직에서 박테리아 유전자 조절을 연구하는 형광 기반 방법. J. Vis. 경험 (2019)

이 영상은 이중 형광 리포터를 이용해 감염된 마우스 신장 조직을 준비하고, DNA 염색하며, 박테리아 유전자 발현을 검출하는 방법을 시연합니다. 빨간색은 모든 박테리아를, 초록색은 감염 반응성 세포를 표시합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 심사 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. 장기 적출과 조직 처리
   1. 2차 방법으로_CO2 흡입과 자궁경부 탈구로 동물을 안락사시키고, 부검을 실시합니다.
   2. 신장(오른쪽)과 심장, 간, 폐, 비장과 같은 주요 장기를 채취하여 10% [v/v] 완충 포르말린이 포함된 15mL 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다.
   3. 장기를 어둠 속에서 실온에서 부드럽게 흔들거나 회전시키며 최소 24시간, 최대 48시간 동안 고정하세요.
   4. 장기를 투명한 조직 냉동 배지에 삽입하고 조직을 -80°C에 보관합니다.
   5. 크라이오스탯을 사용해 조직을 두께 10μm의 조각으로 나눕니다.
   6. 미리 청소된 충전된 유리 슬라이드에 20분간 어두운 상태에서 말리세요. 4피트 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 염색제와 커버슬립이 포함된 하드 마운팅 매체를 바르세요. 큐어 슬라이드를 실온에서 하룻밤 두고 4°C로 옮겨 장기 보관합니다.
2. 레이저 주사 공초점 현미경 및 영상 처리
   1. 형광 리포터에 적합한 레이저를 사용해 병변을 찾기 위해 장착된 슬라이드를 검사합니다. 이 경우 녹색(GFP 또는 녹색 형광 단백질), 빨간색(tdTomato), 파란색(DAPI) 형광 신호가 사용됩니다.
   2. 개별 세포를 시각화할 적절한 대물렌즈(예: 보통 20배 또는 40배 대물렌즈를 사용)를 사용하여 이미지를 획득하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57Bl/6 마우스	찰스 강	NA
공초점 레이저 주사 현미경	자이스	NA
크라이오스탯 미크토름	써모 사이언티픽	NA
인산염 완충 식염수 (PBS)	셀그로우	46-013-CM
Precellys 24 균질기	버틴 연구소	NA
서브 제로 투명 조직 냉동 배지	메르세데스 메디컬	MER5000
슈퍼프로스트 플러스 현미경 슬라이드	피셔 사이언티브	12-550-15
DAPI가 적용된 벡타쉴드 안티페이드 마운팅 매체	벡터 연구소	H-1500