생세포 형광현미경을 이용한 박테리아의 형태학적 변화 영상

초록

출처: 브조조프스키, R. S. 외 박테리아의 세포 내 세포 내 단백질 위치 및 세포 형태 변화를 조사하기 위한 생세포 형광 현미경. J. Vis. 경험 (2019)

이 영상은 박테리아의 형태학적 변화를 실시간으로 시각화하기 위한 생세포 형광현미경을 시연합니다. 이 문서는 실시간으로 고해상도 이미지를 얻기 위한 영상 촬영, 타임랩스 획득, 디컨볼루션 과정을 개괄합니다.

프로토콜

1. 영상

1. 실험 당일, 현미경 시스템을 켜세요. 영상 소프트웨어( 재료표 참조)를 시작하려면 바탕화면의 해당 아이콘을 클릭하세요. 소프트웨어 시작 대화상자에서 현미경이 표시된 초기화 옵션( Initialize Microscope ) 옵션을 클릭하여 현미경을 초기화하세요. 초기화 전에 현미경 거칠 조정을 통해 대물렌즈가 완전히 낮아졌는지 확인하세요.
   참고: 초기화 후에는 시작 메뉴 외에도 세 개의 추가 대화 상자가 나타납니다: resolve3D, 데이터 수집, 필터 모니터.
2. 제조사에서 제공한 100배 오일 침수 대물렌즈에 1.517(굴절률) 오일을 떨어뜨립니다(수치 조리개 = 1.4, 작업 거리 = 0.12 mm; 재료표 참조).
   참고: 영상 촬영이 이루어지는 온도에 맞는 적절한 침수 오일을 선택하는 것이 중요합니다.
3. 샘플이 담긴 유리 바닥 접시를 금속 하우징(관)에 넣고 부드럽게 무대 클램프에 넣습니다.
4. 거친 조절 노브를 사용해 대물렌즈를 들어 올려 기름이 접시 유리 바닥에 닿게 하세요. 접안렌즈와 미세 조절 노브를 사용해 샘플을 초점에 맞추세요. 셀이 초점이 맞춰지면, 현미경 본체 앞면에 위치한 선택 스위치를 왼쪽으로 움직여 접안렌즈에서 카메라 모드로 노브를 돌립니다.
5. 영상 소프트웨어를 사용해 실험을 시작하세요. resolve3D 창에서 플라스크로 표시된 설계/실험 실행 아이콘을 선택하세요. ' 설계/실험 실행'이라는 새로운 대화 상자가 나타날 것입니다.
   1. 설계와 실험 실행 대화상자에서 단면 탭을 사용해 Z-스택 수와 샘플 두께를 설정하세요.
      참고: 대표 결과 섹션의 실험에서는 정지 이미지에 200 nm 간격의 17개의 Z-스택을, 타임랩스 현미경을 위해 200 nm 간격의 Z-스택 4개를 사용했습니다.
   2. 샘플 내 셀 두께를 측정하려면 resolve3D 대화상자의 위아래 화살표를 사용해 Z-평면을 점진적으로 수동으로 조정하세요. 셀이 초점이 흐려지는 지점을 이미지 획득의 상한선과 하한선으로 표시하세요. 실험을 실행하기 전에 이 정보를 가져오세요.
   3. 타임랩스 영상 중 광독성과 광표백을 최소화하기 위해 Z-스택 수를 줄이고 이미지 획득을 위해 세포의 중간 평면을 선택하세요.
6. 설계 및 채널 탭을 사용하여 실험에 적합한 필터 세트를 선택하고, 설계/실행 실험 대화상자에서 채널 탭을 선택하세요 (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: 전 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. 또한, POL/DIC 정보 수집에 참고문헌을 선택하세요. resolve3D 대화상자에서 적절한 옵션을 선택해 영상 촬영 전에 선택한 개별 채널의 투과율(빛 세기)과 노출 시간을 조정할 수 있습니다.
      참고: 실험에 포함되지 않는 테스트 시야에서 이러한 설정을 테스트하여 선택된 매개변수가 약한 신호를 누락하거나 과포화 없이 의미 있는 형광 데이터를 얻는지 확인합니다. 그 다음 실험 설정에 필요한 매개변수들을 가져오세요.
7. resolve3D 대화상자에서 포인트 리스트 버튼을 선택하여 포인트 리스트를 엽니다. 새로운 대화 상자가 '포인트 리스트'라는 제목으로 나타납니다. 현미경 스테이지 컨트롤을 사용해 적절한 시야를 찾고 포인트 리스트 대화상자에서 포인트 표시 옵션을 선택하여 실험에 사용할 여러 시야를 표시하세요.
   참고: 점목록의 특정 점에 현미경이 다시 초점을 맞출 때마다 교체 지점을 선택해야 합니다. 이는 현미경을 리스트 내 적절한 지점에 초점을 맞추고 교체 버튼을 선택하는 방식으로 할 수 있습니다. 리포커스 시 아날로그 거칠/미세 조정 노브를 만지지 않는 것이 중요합니다; 초점을 조정하려면 소프트웨어만 사용하세요.
8. 먼저 설계를 선택한 후 설계/실험 실행 대화상자에서 타임랩스 탭을 선택하여 타임랩스 매개변수를 설정하세요. 타임랩스 체크박스를 선택하세요. 타임랩스 이미지/총 시간 기준으로 적절한 타임랩스 매개변수를 입력하세요.
9. 포인트 목록에서 이미지를 설정할 수 있도록 설계를 먼저 선택한 후 설계/실험 실행 대화 상자에서 포인트 탭을 선택하세요. 방문 지점 목록 옵션을 선택하고, 완전한 시퀀스라면 쉼표나 하이픈으로 구분된 텍스트 상자에 이미지를 입력하세요.
10. 실험을 시작하기 전에 디자인/실행 대화상자의 실행 탭을 사용하여 파일 이름과 파일 위치를 편집하세요. 파일 위치는 설정 버튼을 선택하고 데이터 폴더를 선택한 후 적절한 폴더를 선택하거나 새로 생성하여 변경할 수 있습니다. 이미지 파일 이름 텍스트 박스에 새 파일 이름을 입력하여 파일 이름을 변경하세요.
11. 실험 시작 대화상자에서 재생 버튼을 선택하여 실험을 시작하세요.
    참고: 타임랩스의 경우, 실험 내내 DIC 설정을 사용해 각 시야각의 초점을 지속적으로 확인하고(불필요한 광표백을 방지), 셀이 시간이 지남에 따라 초점이 흐려지는 경향이 있으므로 포인트 리스트의 정보를 다시 초점 맞추고 업데이트하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	피셔 바이오리시약	BP160-100	분자생물학 등급 - 저평생 농업률
FM4-64	인비트로젠	T3166	현미경
유리 바닥 접시	맷텍	P35G-1.5-14-C	현미경
현미경	GE	델타비전 엘리트	맞춤형 올림푸스 IX-71 역현미경 스탠드; 맞춤형 조명탑과 투과광 조명 모듈. 대물렌즈: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); 올리 100X 오일(N.A. 1.4, WD 0.12 MM); 100X 목표 팀의 DIC 프리심 노마르스키; 쿨스냅 HQ2 카메라; SSI 어셈블리 7-컬러; 환경 제어 챔버 - 불투명함.
PC190723	밀리포어 시그마	3445805MG	FtsZ 억제제
소프트웍스	GE		제조사 제공 이미징 소프트웨어