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동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.
1. 꼬리 정맥 주사를 통한 쥐에 리스테리아 모노사이토제네스 접종 및 간, 비장, 심장 내 박테리아 부하 평가
참고: 모든 동물 관련 작업은 CDC 생물안전 2단계 지침에 따라 수행됩니다. 쥐는 보통 일주일 전에 주문되어 5마리의 동물과 함께 우리에 넣습니다. 쥐들은 주입 전 4일간 새로운 실험실 환경에 적응하도록 합니다. 이 실험들은 6-8주 된 암컷 스위스-웹스터 쥐를 5마리씩 한 우리에 장벽 환경에 넣고 제한 없는 식단을 먹였다.
- 뚜껑과 먹이/물통을 열기 위해 한 번에 한 마리씩 쥐를 준비하고, 우리를 열 램프 아래에 5분간 두세요. 이 과정은 꼬리 정맥을 확장시켜 주사 시술을 더 쉽게 할 수 있게 합니다.
- 주사 중 동물을 제지하기 위해 한 마리의 동물을 제거해 하네스(또는 끝이 잘린 매관 형태)에 착용하세요.
- 주사 부위를 알코올 패드로 청소하고 알코올이 증발하도록 기다려 두세요. 이 방법은 부위를 정화할 뿐만 아니라 꼬리 정맥을 더욱 확장시킵니다.
- 27.5게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용해 원하는 배양액 200μl을 꼬리정맥에 부드럽게 주입합니다.
- 주사 후 발생할 수 있는 출혈을 막기 위해 거즈를 사용하고, 동물을 새 우리에 넣으세요.
- 이 과정을 남은 동물과 품종에 대해 반복합니다. 각 우리에 접한 품종을 반드시 라벨링하세요.
- 매일 동물들을 점검하며, 아픈 것으로 보이는 동물을 제거하고 희생시키세요. 동물이 아픈 징후를 보이지 않는다면, 감염이 진행된 후 72시간 동안 모든 동물을 희생시키도록 두세요.
- 희생 시에는 모든 호흡이 멈출 때까지 병에 담긴CO2 마취를 사용한 후, 경추 탈구를 사용해 동물이 완전히 죽었음을 확인시켜야 합니다.
- 희생 후 동물들을 조직 배양 후드로 옮겨 해부합니다.
- 해부 블록을 사용해 동물의 각 다리를 굵은 바늘로 고정하고, 70% 에탄올을 분사하여 포화 상태가 되도록 하세요.
- Y 자형 절개를 통해 복부와 흉부 피부를 뒤로 자르는데, 이 절개는 질 개구에서 상골 돌기까지 이어지고, 그 후 각 팔의 겨드랑이까지 이어집니다.
- 피부를 뒤로 젖히고 각 다리의 바늘을 제거해 해부를 열어 두세요.
- 복막을 부드럽게 절단하여 장, 위, 간, 비장을 노출시킵니다.
- 먼저 간 상단의 간정맥과 관상인대를 절단하여 간을 제거하기 시작하세요. 추가 인대는 간 아래에 위치해 소장의 첫 번째 부위와 등 근육과 연결됩니다.
- 간을 50ml 팔콘 튜브에 5ml 멸균 ddH2.0에 넣으세요.
- 다음으로, 비장을 분리하여 혈관과 인대를 부드럽게 절단하여 제거합니다. 비장은 간보다 더 쉽게 제거됩니다. 비장을 5ml 멸균 ddH20이 들어 있는 별도의 팔콘 튜브에 넣으세요.
- 횡격막을 찾아 갈비뼈를 따라 부드럽게 자르면서 흉부를 시각화하세요. 흉골 돌기와 흉골을 목 높이까지 절단하여 흉부를 열어 심장과 폐를 노출시킵니다.
- 겸자를 사용해 심장 꼭대기를 부드럽게 잡고 대동맥과 폐혈관이 장력을 갖도록 들어 올립니다. 이 혈관들을 잘라서 심장을 풀어주세요.
- 심장을 50ml 팔콘 튜브에 넣고, 그 안에 5ml의 멸균 ddH2.0이 들어 있습니다.
- 쥐 사체를 버리고, 각 장기마다 5ml 멸균 ddH2.0이 포함된 깨끗한 팔콘 튜브를 사용해 모든 동물에게 이 과정을 반복하세요.
- 모든 장기를 제거한 후에는 작업대를 청소하고 작업대로 돌아가세요.
- 5마리 쥐의 각 장기 세트별 균질제를 세척하고 멸균하는 데 사용할 5개의 관 세트를 준비하세요(즉 , 5개의 간 5개 세트, 5개의 비장용 5개 튜브, 5개의 심장 5개 세트). 각 튜브 4개에는 30ml 멸균 DDH20, 1개는 30ml 90% EtOH로 채워야 합니다.
- TissueMaster(또는 동등한 균질기)를 사용해, 1.21단계에서 준비한 튜브에 균질기를 담가(작동 중) 프로브를 세척하는 방법:
- 튜브 1 (ddH2O) 튜브 2에서 5초 (ddH2O) 튜브 3에서 5초 (EtOH) 튜브 4에서 5초 (ddH2O) 튜브 5초 (ddH2O)
- 균질제를 사용해 최소 2분 이상 또는 장기의 보이는 부분이 사라질 때까지 한쪽 간을 균질화합니다. 핀셋을 사용해 프로브에서 큰 이물질을 제거하세요.
- 설명한 청소 과정을 반복하세요.
- 다른 간에도 균질화 과정을 반복하며, 설명된 방법으로 각 간 사이에서 프로브를 세척하세요.
- 모든 간이 완전히 균질화된 후에는 간을 위한 세척관(1-5)을 버리세요.
- 비장과 심장 모두에 대해 균질 및 세척 과정을 반복하며, 각 장기 시리즈마다 새로운 세척관을 사용하세요. 세척관이 탁해지면 버리고 새 튜브로 교체하여 시리즈를 마무리하세요.
- 모든 장기가 균질화된 후, 균질제에 마지막으로 세척 사이클을 한 번 더 하고 잘 건조시켜 보관하세요.
- 각 기관의 약 200μl을 96웰 플레이트의 개별 웰에 배치합니다.
- 장기 샘플에 대해 연속 희석을 수행하는데, 1:10 희석을 연속으로 하여 최대 1:10,000 희석(간 및 비장) 또는 최대 1:1,000 희석(심장)까지 희석합니다.
- 희석 계열을 미리 데운 LB 한천에 스팟 플레이트로 바릅니다. 또한 희석되지 않은 각 장기와 플레이트를 각각 20 ul 추출하여 별도의 LB 한천 플레이트에 올려 약한 정식 장기에서 CFU를 계수합니다.
- 균질화된 장기가 담긴 팔콘 튜브는 버리고, 희석 시리즈가 포함된 96웰 플레이트를 파라필름으로 감싼 후 -80 °C의 냉동고 상자에 보관합니다.
- 얼룩이 마르도록 하세요. 이 과정은 판을 후드에 넣고 뚜껑을 열어 빠르게 진행됩니다.
- 반점이 마른 후에는 플레이트를 37°C 인큐베이터에 하룻밤 넣어두세요.
- 다음 날 아침 각 지점의 군집 수를 세고 희석 수열을 사용해 장기별 박테리아 총 수를 계산하세요.