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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 심사 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.
1. 감염
- 10주에서 12주 사이의 남녀 모두 BALB/c 마우스를 채취하세요.
참고: Streptococcus pneumoniae 혈청형 4 균주 TIGR4는 염기성 임상 분리균으로, 시퀀싱이 완료되었습니다. - TIGR4를 Todd-Hewitt 육수에서 37°C, 5%CO2 에서 광 밀도(OD)620 이 0.5(1.0 x 108 콜로니 형성 단위[CFU]/ml)에 도달할 때까지 배양합니다. 폐렴구균 배양액을 3,500 x g에서 10분간 원심분리하여 펩릿으로 포착한 후 진공 라인으로 상청액을 제거합니다. 박테리아를 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 부탁 및 희석하여 최종 농도인 1.0 x 104 CFU/ml로 만듭니다.
- 유도 챔버를 사용해 산소에 2.5% 기화된 이소플루란으로 쥐를 마취합니다. 무딘 핀셋으로 부드럽게 발가락을 꼬집어 마취 상태를 확인하세요.
- 마취된 쥐를 한 손으로 목덜미를 잡고 세운 채, 27-30 게이지 바늘이 달린 주사기(도전 용량 1.0 x 103 CFU)를 사용해 각 마우스를 복강 내(ip.)로 주입합니다. 쥐를 다시 우리에 넣으세요. 쥐는 보통 주사 후 30-40초 후에 깨어납니다.
- 감염이 최소 24시간(초기) 또는 30시간(진행)까지 진행되도록 기다려 주세요.
- 쥐를CO2 질식으로 안락사시키세요. 쥐가 죽었는지 확인하기 위해 경추 탈구를 시행하세요. 1.6단계에서 심장을 제거함으로써 안락사가 더욱 확정됩니다.
- 알코올 면봉으로 꼬리를 소독하고 2-3mm 절개를 잘라내세요. 혈액 2μl을 채취하고, 나트륨 헤파린 1 U/ml가 포함된 PBS를 10배로 연속적으로 다섯 번 희석합니다. 트립틱 대두 혈액 한천 플레이트에 연속 희석을 배제하고, 5%CO2 중 37°C에서 하룻밤 배양합니다. 다음 날, 군체에서 세균혈증 수준을 계산합니다.
- 쥐를 수술용 플랫폼 위에 누운 상태로 고정시킵니다. 가슴에 70% 에탄올을 뿌리고 두드려 말리세요. 수술용 가위와 겸자를 사용해 흉강을 열고 갈비뼈를 제거한 뒤 횡격막을 절단하여 심장과 폐를 노출시킵니다. 가위를 사용해 심장과 연결된 혈관을 자르고, 겸자로 멍이 들지 않도록 조심스럽게 심장을 절제합니다.
- 심장을 PBS로 헹군 후 조직 표본 수집 카세트에 넣어 조직 절편 검사 시 코로나 절제를 얻도록 합니다. 파라핀 임베딩의 경우, 카세트를 10% 완충 포르말린 용액에 넣고, 다음 날 파라핀 메베딩을 진행하세요.
- 또는 드라이아이스 위에 올려진 크라이오몰드 안에 최적의 절단 온도(O.C.T.) 화합물을 사용하여 급속 냉동을 할 수도 있습니다.
2. 병변 내 심장 병변 및 폐렴구균의 시각화
- 파라핀이 박힌 심장 절편을 잘라내어 각 조직 절면에서 심장의 4개 방이 보이도록 합니다. 슬라이드는 두께 5μm로 절단합니다.
- 표준 방법으로 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 슬라이드를 탈파라핀 및 염색합니다.
- 광학 현미경으로 낮은 배율(100배, 200배)과 높은 배율(유성 침지: 400배, 1,000배)에서 H&E 염색된 심장 절편을 관찰할 수 있습니다. 심장에서 심근에 미세병변이 있는지 특성화합니다. 여기서는 100X 1.3 수치 구경 Plan-NEOFLUAR 대물렌즈가 장착된 Zeiss Axioskop 2 현미경을 사용해 H&E 이미지를 획득합니다.
참고: 초기 단계에서 심장 병변은 색상의 차이와 경우에 따라 면역 세포(단핵구 및 과립구)의 존재로 구별되며, 이들은 단핵구로 보입니다. 특히 30시에 관찰되는 진행된 병변에서는 면역 세포가 없고, 대신 큰 공포 모양의 병변이 관찰됩니다. 심장 병변 초기 단계에서 면역 세포 유입이 발생할 수 있지만, 필수 조건은 아닌 것으로 보인다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.