표면에서 유도된 박테리아 병원성 스크리닝을 위한 신속한 영상 기반 분석

초록

출처: 페린밤, K., 시리아폰, A. 아메바를 이용한 신속 영상 기반 박테리아 병원성 분석. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 아메바를 표면에 부착된 박테리아나 플랑크톤성 박테리아와 함께 배양하고, 칼세인-아세톡메틸 에스터(칼세인-AM) 아가로스 패드를 적용하며, 형광 영상을 이용해 숙주 세포 손상을 감지하는 빠른 이미지 기반 탐지 방법을 시연합니다.

프로토콜

1. 현미경 - 한천 패드 준비

1. 아메바가 Pseudomonas aeruginosa와 섞기 준비되기 약 30분에서 1시간 전에 한천 패드를 준비하세요.
2. 250mL 플라스크에 1%(w/v) 한천 50mL를 현상 버퍼(DB)에 전자레인지로 돌립니다. 한천 덩어리가 사라질 때까지 20초마다 섞어주세요.
3. 녹은 한천을 55°C 예열된 물에 15분간 넣어 식힙니다.
4. 원뿔형 튜브에 15 μL 칼세인-AM 스톡 용액을 15mL 용융 한천에 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 4-5번 뒤집어 섞고 바로 다음 단계로 넘어가세요.
   참고: 이 과정을 폴리프로필렌 15mL 원심분리관에서 수행하세요. 두꺼운 유리 용기는 사용하지 마세요. 한천이 너무 빨리 굳어버릴 수 있습니다.
5. 용융된 한천 혼합물을 12cm x 10cm 크기의 유리판 위에 부어 상온에서 10분간 굳히게 합니다. 굳어진 한천 패드를 인쇄된 격자 위에 유리판을 올려놓고 금속 자로 격자를 따라 자르면서 1.5cm x 1.5cm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
6. 젤은 사용할 준비가 될 때까지 습한 상자에 수분을 공급해 두세요.

2. 현미경 - 이미징을 위한 박테리아-아메바 샘플 준비

1. 표면에 부착된 박테리아 세포의 병원성을 측정하기 위해, 표면에 부착된 박테리아에 아메바 세포 10 μL을 첨가합니다.
   참고: 이 단계는 아메바와 박테리아를 혼합하는 과정을 설명합니다.
2. 플랑크톤 세포의 병원성을 측정하기 위해 아메바 세포 10 μL과 플랑크톤 박테리아 10 μL을 혼합합니다.
   참고: 박테리아와 혼합하기 전에 액세로 배양된 아메바 세포(OD₆₀₀ 0.2에서 0.5)를 세척하지 마세요. 항생제-항균류 용액 사용으로 인해 아메바 배양에서는 대장균 성장이 관찰되지 않습니다.
3. 즉시 1.5단계 1.5 x 1.5cm 크기의 칼세인-AM 한천 패드를 박테리아-아메바 혼합물 위에 페트리 접시 표면에 올려놓으세요.
   참고: 한천 패드를 빠르고 부드러운 동작으로 혼합물 위에 올려놓으세요. 패드를 천천히 혼합물 위에 내리지 마세요. 이 동작은 세포를 주변부 쪽으로 밀어내고 패드 밑면에서 멀어지게 만듭니다. 이 단계는 박테리아와 아메바가 고르게 혼합되어 고정되도록 하며, 두 세포 유형이 같은 평면에 갇히도록 보장합니다.
4. 한천 패드 주변에 남은 액체를 부드럽게 피펫으로 제거해 과잉 액체를 제거합니다. 페트리 접시를 실온에서 20분간 말리세요.
5. 페트리 접시에 뚜껑을 덮고 고정된 아메바-박테리아 혼합물을 상온에서 추가로 40분간 배양하세요. 3.1단계로 진행하세요.
   참고: 배경 형광이 시간이 지남에 따라 증가하기 때문에 모든 샘플을 동일한 시간 동안 배양하는 것이 중요합니다. 부화 시간은 1시간이 권장됩니다. 1시간 이상 잠복하면 아메바 세포가 터질 수 있어 재현성이 떨어집니다.

3. 현미경 - 이미지 획득

1. 밝은 필드 및 녹색 형광 이미지를 획득할 수 있는 형광 현미경을 이용한 아메바 영상. 녹색 형광의 경우, 각각 474/27 nm와 525/45 nm의 녹색 형광 단백질(GFP) 필터를 사용하여 여기와 방출을 수행합니다. 10배(≥0.3) 대물렌즈를 사용해 아메바를 촬영하세요.
   참고: 한천 내 칼세인-AM은 죽어가는 아메바가 녹색 형광 채널에서 형광을 하게 합니다. 건강한 아메바는 그 외에는 형광성이 없습니다.
2. 위상 차이, GFP 채널을 통해 광독성을 제한하고 이미지 강도의 동적 범위를 최적화하기 위해 획득 시간을 조정하세요. 필요하다면 차동 간섭 대비(DIC) 위상 대비로 대체할 수 있습니다.
   참고: 위상 대비와 GFP 형광을 위해 100-200ms 노출을 사용하세요. 실험 내내 노출과 기기 설정은 변하지 않도록 유지하세요. 이는 숙주 살해 지수를 계산하는 데 매우 중요합니다.
3. 숙주 살해 지수 계산을 위한 좋은 통계를 얻기 위해 최소 100개의 아메바 세포에 대한 이미지를 획득하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
백토 한천, 탈수 상태	BD 디프코	214010
항생제-항균제(100X)	라이프 테크놀로지	15240062	1 mL< 알리코트하여 -20 °C에서 보관합니다
칼세인-아세톡시메틸 에스터 (칼세인-AM)	라이프 테크놀로지	C34852	칼세인 아세톡시메틸 (AM)
무수성 염화칼슘	시그마-올드리치	C1016
D-포도당	피셔 케미컬	D16500	포도당
디메틸 설폭사이드	시그마-올드리치	D5879
엽산	시그마-올드리치	F8758
LB-밀러	BD 디프코	244620
염화마그네슘	시그마-올드리치	M8266
효모 추출물	옥소이드	LP0021
특수 펩톤	옥소이드	LP0072
히로옥사이드 칼륨	피셔 케미컬	P250
인산칼륨 단염성	시그마-올드리치	P0662
인산나트륨 이염성 일산화물 헵타하이드레이트	피셔 케미컬	S373
비타민 B12	시그마-올드리치	V2876
계통
디크티오스텔리움 디스코이데움	시리아폰 연구소	스트레인 AX318
대장균	시리아폰 연구소	변형 B/r17
Pseudomonas aeruginosa(슈도모나스 아에루기노사)	시리아폰 연구소	PA14	PA14 변종19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	시리아폰 연구소	AFS20.1	PA14 기반 균주 20
보급품
0.22 μm 필터	밀리포어	SCGPT01RE	필터 멸균을 위해
원뿔관 15mL	코닝	352097
유리 저장 병	파이렉스	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
페트리 접시, 지름 6cm	코닝	351007	60 x 15 mm 폴리스티렌 판
페트리 접시, 지름 10cm	피셔	FB0875712	100 x 15 mm 폴리스티렌 플레이트
뚜껑이 있는 플라스틱 용기	지퍼락	2.57E+09	정사각형 3컵 용기
유리판	바이오-래드	1653308	한천 패드 준비를 위해서요. 비슷한 크기의 다른 유리판도 사용될 수 있습니다.
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장비
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