동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.
1. 구인두에서 발생한 클렙시엘라 폐렴의 기관내 흡인 마우스
- 쥐는 꼬리 표시, 문신 또는 기타 승인된 식별자로 고유하게 식별되도록 하세요.
- 이소플루란에서 쥐를 제거하기 전에 P200 피펫으로 박테리아 투여 접종액을 채취하여 절차를 신속하게 진행하세요. 이송 흡인 시 최상의 결과를 위해서는 넘침을 방지하기 위해 <100 μl의 부피를 사용하세요. 여기서는 2000 콜로니 형성 단위(CFU)/50 μl K. pneumoniae를 사용하세요.
- 쥐를 투명한 챔버에서 아이소플루란 가스(예: 1 L/min 유속 2% 아이소플루란)로 마취하거나 기관 지침에 따라 마취합니다. 함께 마취할 쥐 수는 실험자의 편안함 수준에 따라 결정되며, 보통 한 번에 1-2마리씩 이루어집니다. 호흡을 관찰하고 깊은 호흡이 보이고 호흡 사이에 2-3초가 있으면 마취 정도를 확인하세요. 참고: 휘발성(흡입) 마취제의 혼란 효과가 우려된다면, 대신 케타민/자일라진의 복막 내 주사로 마취를 할 수 있습니다. 위에서 설명한 방법에서는 깊은 마취가 몇 분밖에 지속되지 않습니다. 더 오랜 기간 마취가 유도될 경우, 안구 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 사용해야 합니다.
- 마취 후에는 반쯤 누운 자세로 눕히고, 상악 앞니로 고무줄을 고정해 기울어진 플렉시글라스 보드의 핀 사이에 매달아 놓습니다(그림 1).
- 무딘 무딘 융기가 없는 겸자로 마우스 혀를 부드럽게 옆으로 당기고, P200 피펫으로 구강에 투여량을 주입하세요. 혀나 구인두에 외상을 유발하지 않도록 매우 주의하세요.
- 혀를 접은 채 장갑 낀 손가락으로 코를 부드럽게 막아 쥐가 숨을 들이쉴 때까지 기다립니다. 쥐가 두 번 이상 흡입할 때까지 코를 계속 덮고, 구강 안에 액체가 보이지 않을 때까지 계속 덮으세요. 코를 가리면 쥐가 박테리아를 폐로 흡입하도록 도와주는데, 쥐는 코로 숨 쉬는 것이 강렬하기 때문입니다.
- 쥐를 접종판에서 꺼내 다시 케이지로 돌아가, 마취에서 회복하는 동안 침대나 이물질이 콧구멍을 막지 않도록 등을 대고 눕히세요.
- 모든 쥐가 투여받고 마취에서 깨어나면, K. pneumoniae 에 주사된 쥐만 있는 칸막이나 방에 쥐를 가둡니다. 감염 후 48시간을 넘기면 체중을 포함한 쥐를 매일 모니터링하세요.
- 쥐가 48시간을 넘길 경우 매일 매시나 보충 가열을 사용하세요.
2. 폐 및 말초 조직의 박테리아 부하 측정
- 시작 전에: 폐와 비장에 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS) 900 μl, 혈액에 1x PBS 90 μl 희석관을 준비하세요. 박테리아 배양용 라벨 플레이트를 실온에 두세요; 따라서 조직이 채취되면 균질화와 박테리아 배양 도금 사이의 시간이 최소화됩니다.
참고: 흡인으로 인해 폐에 박테리아가 이질적으로 침착할 수 있기 때문에, 전체 기도 세포 또는 총(양측) 폐 세균 부하 분석에는 개별 마우스를 사용하는 것이 권장됩니다. - 기관 지침에 따라 쥐를 안락사하세요. 여기서는 150 mg/kg 펜토바르비탈나트륨 또는 상급 용량의 상업용 안락사 용액을 치명적으로 주사한 뒤, 출혈을 시행하는데, 이는CO2 흡입과 경추 탈구로 인한 폐 합병증을 피하기 위함입니다.
- 비장을 제거하고 1x PBS 2ml에 넣으세요. 튜브를 얼음 위에 올려놓으세요. 각 조직과 쥐 사이에 에탄올로 기구를 깨끗이 청소하세요.
- 조직을 얼음 위에 균질화하고, 가능하면 샘플마다 교체할 수 있는 일회용 균질제로 만듭니다. 일회용 균질화 팁은 실험 간 재사용을 위해 오토클레이션할 수 있습니다.
- 조직이 균질화되면 연속 희석과 판을 수행합니다. 특정 조직/희석액의 샘플을 단일 트립틱 대두 한천(TSA) 플레이트에 분할선을 그려 샘플링합니다. 아래 판금 및 희석 제안은 다음과 같으며(모든 경우 10μl의 샘플이 판에 퍼집니다), 감염 후 24시간 부검을 기반으로 합니다. 48-72시간 샘플을 분석할 경우, 이후 시점에 박테리아 부하가 증가하여 더 많은 희석액을 도판해야 할 수 있습니다
- 비장의 경우, 균질화된 비장 100 μl을 멸균 1x PBS 900 μl에 연속적으로 첨가하여 1:10에서 1:100으로 희석합니다. 플레이트를 깨끗하게 균질화하고 두 희석을 모두 두 번 섞어 넣으세요.
- 스프레드 샘플을 잠시 건조시키세요.
- TSA 플레이트를 뒤집어 37°C 정식 인큐베이터에 하룻밤 보관하세요.
- 플레이트 양면과 각 희석 시점의 박테리아 집락 수를 평균하여 집집 박테리아 수를 결정합니다. 폐에 5ml, 비장에 2ml의 초기 희석을 고려하여 전체 조직 CFU를 산정합니다.
