감염된 쥐의 장 조직에서 아미노산 대사산물의 시각화

초록

출처: Specker, J. T. 외 감염 중 한천과 조직에서 배양된 박테리아 군락의 영상 질량분석법을 통한 미생물 협력 조사. J. Vis. 경험 (2022)

이 영상은 클 로스트리디오이데스 디피실에 감염된 쥐의 장 조직 내 아미노산 분포를 단독으로, 또는 Enterococcus faecalis와 병용하여 시각화하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량분석법을 시연합니다. 이 절차는 조직 준비, 기질 도포, 레이저 이온화, 아미노산 이온 검출을 통해 공간 이온 이미지를 생성합니다. 결과는 E. faecalis 가 오르니틴을 방출하고 아르기닌을 고갈시켜 장내 환경을 변화시키고, 이를 통해 C. difficile 의 병인성을 강화하는 미생물 협력을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 비감염 대조군 및 C. difficile 감염 마우스 맹장 조직의 준비 및 운송
   1. 4-8주 된 수컷 쥐 C57BL/6마리에게 항생제(0.5 mg/mL 세페페라존 또는 0.5 mg/mL 세페페라존 + 1 mg/mL 반코마이신)를 5일간 음 용수에 접종하고, 이후 2일간 회복 후 감염을 시행합니다.
   2. 동물들을_CO2 질식사로 안락사시키고, 쥐의 맹장 장기를 즉시 채취하세요. 증류수에 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 20% 혼합물에 박습니다.
   3. 샘플을 드라이아이스 위에 올려놓고 포장하여 분석을 위해 배송합니다; 분석할 때까지 -80 °C에서 보관하세요.

 

2. 감염되지 않은 대조군과 C. difficile 감염 마우스 맹장 조직의 냉동절리 비교

1. 모든 냉동분리 장비를 100% 에탄올로 헹구고 건조한 후 샘플을 냉동체에 넣으세요. ITO 코팅 현미경 슬라이드를 준비하려면 옴미터를 사용해 전도 코팅이 있는 슬라이드 면을 식별합니다. 다이아몬드 팁 스크라이브를 사용해 ITO 코팅된 현미경 슬라이드 면에 에칭하고 라벨을 붙입니다.
   참고: 장갑, 실험실 안경, 실험복, 냉동 보존 슬리브 등 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.
2. 연구용 냉동절개를 수행하세요. OCT가 내장된 마우스 세카 조직을 -80 °C 냉동고에서 드라이아이스 위에서 냉동미세절실 챔버(30 °C 챔버 온도, -28 °C 물체 온도)로 옮깁니다. 비교할 조직 샘플을 영상 질량분석법(예: 감염되지 않은 대조군과 C. 디피실 감염 대조군)을 사용해 동일한 조직 유형을 동일한 샘플 준비로 하고 정확한 대사물 비교를 가능하게 합니다.
3. 냉동절출 챔버 내부에서 OCT가 내장된 조직을 추가 OCT 용액을 사용해 샘플 척에 부착합니다. OCT 용액이 굳어진 후에는 척을 시료 헤드에 고정하세요. 원하는 조직 깊이/장기 평면에 도달하기 위해 10-50 μm 단위로 냉동절부를 시작하세요.
4. 조직의 최적 단면에 도달하면 12 μm 두께의 단면을 채취하기 시작한다. 아티스트용 붓으로 조각을 부드럽게 다듬어 테플론 코팅 현미경 슬라이드에 올려놓으세요.
5. ITO로 코팅된 현미경 슬라이드를 조직 조각 위에 굴려 테플론 코팅 슬라이드에서 조직을 집어 나오게 합니다. 해동은 조직 단면을 ITO 코팅 슬라이드 뒷면에 손바닥을 눌러 현미경 슬라이드에 부착합니다. 조직 조각이 반투명에서 불투명/무광 질감으로 전환될 때까지 마운트를 계속 녹여 주세요.
6. 조직 장착 현미경 슬라이드를 드라이아이스 위에 옮겨 건조제가 있는 드라이박스에 옮겨 당일 분석용으로 보관하거나, 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관하세요.

3. 매트 릭스 적용 및 MALDI 영상 질량분석을 위한 비감염 대조군과 C. difficile 감염 마우스 맹장 조직 준비

1. MALDI 매트릭스 적용을 수행합니다(노즐 온도 30°C, 8회 통과, 분당 0.1 mL 유량, CC 패턴, 건조 시간 0초, 10 psi).
2. MALDI 이미징 질량분석법 수행
3. 여러 생물학적 복제체의 이온 이미지를 분석하고, 위에서 언급한 SCiLS 통계 소프트웨어를 사용하여 강도 박스플롯 비교 를 통해 유의성을 평가합니다.
   참고: 적절한 통계적 검정 및 비교는 적용 분야에 따라 다르며, 공간 분할, 분류 모델, 비교 분석을 포함하여 식별 및 상관관계 있는 스펙트럼 특징을 결정할 수 있습니다. 비교 분석에는 중요한 특징에 p-값을 할당하거나, 조직 비교를 위한 주성분 분석 생성, 변이를 식별하기 위한 박스플롯 시각화 등이 포함될 수 있습니다. 또한 영상 질량분석법 후 헤마톡실린과 에오신(H&E) 으로 염색한 조직 절편의 밝시야 현미경을 이용해 조직을 시각화하는 것도 유용합니다. 이를 통해 조직의 형태학적 특징을 명확히 식별할 수 있으며, 훈련된 병리학자와 상담하여 분석할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 μm 타이탄3 나일론 주사기 필터	써모 사이언티픽	42225-NN
1,5-디아미노나프탈렌 MALDI 매트릭스	시그마 올드리치	2243-62-1
20 mL 헨케 젝트 루어 락 주사기	헨케 사스 울프	4200.000V0
275i 시리즈 대류 진공 게이지	커트 J. 레스커 회사	KJL275807LL
스마트빔 II Nd:YAG MALDI 레이저 시스템(2 kHz, 355 nm)이 장착된 7T solariX FTICR 질량분석기	브루커 달토닉스
HPLC에 적합한 아세트산 용액	시그마 올드리치	64-19-7
아세토니트릴, HPLC 적합, 경배 등급, ≥99.9%	시그마 올드리치	75-05-8
수산화암모늄 용액, 28% H2O에 NH3, ≥99.99% 미량 금속 기반	시그마 올드리치	1336-21-6
오토클레이버 가능한 바이오하저드 백: 55갤런	그레인저	45TV10
생물학적 위험 표본 운송 가방 (8 x 8인치)	피셔 사이언티브	01-800-07
뇌 심장 주입 육수	BD 생명과학	90003-040
C57BL/6마리 수컷 쥐	잭슨 연구소
CanoScan 9000F Mark II 사진 및 문서 스캐너	정식 설정(캐논)
CM 3050S 연구용 냉동탐사절단기	라이카 바이오시스템
건조기 캐비닛	시그마 올드리치	Z268135
다이아몬드 팁 스크라이버, 전자현미경 과학	피셔 사이언티브	50-254-51
건조 건조제 펠릿	드라이에라이트	21005
에탄올, 200 프로프	디콘 랩스	2701
flexImaging 소프트웨어	브루커 달토닉스
ftmsControl 소프트웨어	브루커 달토닉스
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메탄올, HPLC 등급	피셔 케미컬	67-56-1
MTP 슬라이드 어댑터 II	브루커 달토닉스	235380
최적 절단 온도(OCT) 화합물	피셔 사이언티브	23-730-571
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