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1. 소분자 억제제가 펠리클 및 바이오필름 콜로니 형성에 미치는 영향 평가
- 칼슘 클로라이드와 염화철(III) 육수화물 없이 정의된 바이오필름 유도 MSgg(일나트륨 글루타메이트-글리세롤) 배지 2x 용액을 준비합니다. 필터 멸균 후에는 염화칼슘을 추가하세요. 매체는 직접 사용할 수 있으며, 어두운 곳에서 4°C로 보관할 수도 있습니다.
- 실험 당일에 1배 MSgg 희석액을 준비하세요.
- MSgg 배지 2개를 멸균 증류수(펠리클) 또는 멸균 3% 고온(80°C) 한천(바이오필름)으로 희석하고, 염화철(III) 육수화물을 최종 농도인 50 μM(펠리클) 또는 250 μM(바이오필름)으로 첨가합니다. 항생제나 소분자 억제제를 원하는 농도에 첨가하고 잘 섞으세요. 예를 들어, 30ml에서 0.5 mM D-류신의 최종 농도를 얻어 펠리클이나 바이오필름을 형성하려면 76.3 mM(10 mg/ml) D-류신 스톡 용액 196.6 μl을 첨가합니다.
참고: 최종 1x MSgg 조합은 표 1에 설명되어 있습니다. 원래 레시피와 비교했을 때, 배지에는 50 μg/ml의 트레오닌이 포함되어 있었고, 고체 MSgg 배지에서 바이오필름 군락을 성장시키기 위한 철 농도는 주름진 군락 형태를 최적화하기 위해 2.5배로 증가했습니다.
- 한천이 굳은 후, 접종 전 고체 MSgg 플레이트를 생물학적 후드에서 30-45분간 건조시킵니다.
- 펠리클 형성 메커니즘을 방해하는 특정 억제제를 선택하기 위해(그림 1), 사용된 농도가 플랑크톤 및 정적 성장에 영향을 미치는지 배제합니다.
- 정지 성장 단계까지 매시간 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 단순 성장 곡선에서 플랑크톤 성장(액체 배양 내 광학 밀도 증가)을 결정합니다.
- 측정된 배양 탁도가 살아있는 세포 수를 나타내는지 확인하기 위해, 여러 시점에서 흔들림 배양을 통해 플랑크톤 성장기의 세포 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 구출합니다.
- 소분자 억제제가 정적 세포 성장에 미치는 영향을 평가하기 위해, 24웰 세포 배양 웰에서 23°C에서 3일간 배양 후 세포를 1.7-1.9절에 설명한 동일한 조건에서 접종하여 수확하고, CFU를 결정합니다. 이 대조를 위해서는 세포외 기질 성분을 암호화하는 오페론(예: B. subtilis ΔepsH, ΔtasA)이 없는 펠리클 결핍 균주를 사용한다.
참고: 이 균주는 정적인 조건에서도 성장할 수 있지만, 필리클을 형성하는 야생형과 달리 액체-공기 경계면으로 떠다니는 능력이 부족하며, 산소 농도가 증가해 성장이 유리합니다. 따라서 이 세포외 기질 및 펠리클 결핍 균주는 정적 조건에서 성장을 평가하는 데 권장되는 기준 균주입니다.
참고: 아래에서 설명하는 비정준적 D-아미노산인 D-류신의 구체적인 예에서는, 펠리클 형성을 방해하는 농도에서 플랑크톤 및 정적 성장에 미치는 영향이 배제되었다. 플랑크톤 및 정적 성장을 결정하는 방법에 대해 자세히 설명한다.
- -80°C 스톡(20% 글리세롤에 냉동 10개의9 세포/ml을 LB 배양)에서 B. subtilis를 줄로 제거하여 무균 팁이나 어플리케이터 스틱으로 LB-1.5% 한천 플레이트에 단일 콜로니를 분리합니다.
- 30°C에서 하룻밤 재배하세요.
- 중요한 단계: D-류신과 같은 비정규 D-아미노산에 의한 강력한 펠리클 억제를 위해, LB-1.5% 한천 플레이트에서 채취한 단일 콜로니를 3ml LB 육수에 37 °C 안에서 4시간 동안 진동 인큐베이터(진동 속도 200rpm)에서 배양합니다. LB 육수를 6,000 x g에서 4분간 원심분리하여 1.5ml 스타터 배양액을 4분간 원심분리하여 상출액을 제거하고, 펠릿을 1.5ml MSgg 배지에 재현탁하여 접종 전에 바이오필름 유도 MSgg 배지로 교체합니다. 나머지 문화는 버려도 됩니다. 중요: 시스템의 견고성을 보장하기 위해 세척된 스타터 배양액의 600 nm(외약600)에서 광학 밀도는 0.6에서 1 사이여야 합니다.
- 스타터 배양 과정 동안, 3ml의 MSgg 배지를 포함한 12웰 세포 배양 다접시 플레이트를 준비하는데, 이 배지는 소분자 억제제가 없거나 농도 범위(예: 0.3, 0.5, 1 mM D-류신)를 포함합니다. 가장자리 효과를 배제하기 위해 다양한 농도의 위치를 다수 접시 판 전반에 분산시키세요. 또는 1.5ml MSgg 배지를 포함한 24웰 세포 배양 멀티디시 플레이트를 사용할 수도 있습니다.
- 12웰 세포 배양 다접시 플레이트의 웰에 세척된 스타터 배양액 3μl(1:1,000 희석)을 접종합니다.
참고: 더 낮은 희석 비율, 즉 1:500을 사용할 수 있습니다. 이로 인해 펠리클의 발달 기간이 줄어듭니다. - 펠리클을 23°C에서 정적인 조건에서 3일간 키우세요. 이 기간 동안 펠리클을 움직이지 마세요. 이는 필름의 최종 표면 형태에 영향을 줄 수 있습니다.
- 번개를 양안경으로 균일하게 노출한 사진을 촬영하세요. 또는 고해상도 카메라로 펠리클을 사진으로 찍을 수도 있습니다. 불규칙한 빛 각도와 그림자로 인한 아티팩트를 피하기 위해, 카메라를 삼각대에 고정한 채 상향식 사진을 찍고, 양쪽에서 45° 각도의 부드럽고 큰 광원을 사용하세요.
참고: B. subtilis 다세포성을 연구하는 또 다른 방법은 고체 바이오필름 유도 MSgg 배지를 대상으로 한 바이오필름 콜로니 분석법입니다. 펠리클과 마찬가지로 이 분석법은 시공간적 과정을 연구할 수 있게 합니다. 소분자 억제제의 활성 범위가 밝혀지면, 이들이 바이오필름 콜로니 형성에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. - 바이오필름 군락을 배양하려면, 템플릿을 이용해 건조된 MSgg 1.5% 한천 플레이트에 세척되지 않은 전배양물 1.5 μl(Step 1.7)을 대칭적으로 표시합니다 — 8.5cm 직경의 페트리 접시당 4방울 정도입니다. 방울이 접시에 흡수될 때까지 기다렸다가 옮기세요.
참고: 템플릿은 세포가 성장하는 영역 내에서 바이오필름 콜로니의 균등한 분포를 돕습니다. 템플릿을 준비하려면 원래 척도에서 전체 성장 면적을 그려 같은 구역으로 나누고 중심을 표시하세요. 직경 8.5cm의 원형 페트리 접시의 경우, 이는 14cm2 가 하나의 바이오필름 군락에 할당된다. - 플레이트를 30°C에서 3일간 부화하세요. 이 기간 동안 바이오필름 군락이 발달하여 3차원적이고 주름진 구조를 형성합니다.
- 1.11단계처럼 사진을 찍으세요.
표 1. 이 연구에서 사용된 최종 1x MSgg 작문.
| 1.925 mM | 인산칼륨 단염성 |
| 3.075 mM | 인산칼륨 이염기 |
| 100 mM | 3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산, pH 7.1 |
| 2 mM | 육수화마그네슘 클로라이드 |
| 700 μM | 무수칼슘 클로라이드 |
| 50 μMa | 염화철(III) 육수화물 |
| 125 μMb |
| 1 μM | 염화 아연 무수 |
| 2 μM | 티아민 염산염 |
| 50 μg/ml | 트립토판 |
| 50 μg/ml | 페닐알라닌 |
| 50 μg/ml | 트레오닌 |
| 0.5% (v/v) | 무수 글리세롤 |
| 0.5% (w/v) | L-글루탐산 일나트륨 염 하이드레이트 |
| a는 펠리클 분석에 사용된다; B는 바이오필름 분석법입니다 |
