출처: Bucher, T. 외 B. subtilis 바이오필름을 소분자 바이오필름 억제제 특성 모델로 연구하는 방법론. J. Vis. 경험 (2016).
이 영상은 바이오필름 매트릭스 무결성이 세균의 에탄올 내성에 미치는 영향을 미처리된 및 억제제 파괴된 바이오필름의 군락 형성 단위를 비교하여 보여줍니다. 억제제 처리 샘플에서 감소된 CFU는 세포외 기질이 바이오필름 내장된 세포를 항균 스트레스로부터 보호하는 데 필수적임을 보여줍니다.
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방법 논문
바이오필름 매트릭스 무결성 평가를 위한 에탄올 저항성 분석법
237 조회수
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2026년 2월 26일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 에탄올 저항성 분석
- 바이오필름을 배양한 후 30°C에서 68시간 성장 후 면도날과 템플릿의 도움을 받아 바이오필름 군락을 두 동등하게 잘라냅니다.
- 작은 주걱으로 한천판에서 바이오필름 콜로니의 각 절반을 조심스럽게 들어 올려 500 μl 인산 완충 생리식염수(PBS)가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 필요하다면 플레이트에서 남은 세포를 긁어내어 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
참고: 바이오필름 군락의 후반부는 대조군인지 멸균제에 대한 저항성을 시험하는 데 사용되는지에 따라 다르게 처리됩니다. - 대조제를 위해 바이오필름 군락의 후반부를 500 μl PBS에 배양하세요. 멸균제에 대한 저항성을 평가하기 위해, 바이오필름 군락의 후반부를 500 μl 50%(v/v) 에탄올에 옮깁니다.
참고: 차아염소산나트륨과 같은 대체 멸균제도 사용할 수 있습니다. 사용된 모든 멸균제에 대해 예비 실험에서 활성 농도와 배양 시간을 결정하세요. - 바이오필름 군락을 상온의 작업대 위에서 10분간 부양하세요.
- 바이오필름 콜로니를 18,000 x g에서 5분간 원심분리한 후 피펫으로 상청액을 조심스럽 게 제거하세요. PBS 300 μl을 추가하세요.
- 초음파 측정기 마이크로팁으로 세포를 가볍게(진폭 10%, 펄스 5초) 초음파 검사합니다.
참고: 초음파 에너지 덕분에 바이오필름 응집체가 분리될 수 있을 만큼 충분해야 합니다. 하지만 너무 강한 초음파 검사는 세포를 용해시킬 수 있습니다. 사전에 광학 현미경으로 초음파 에너지가 세포를 용해하지 않고, 모든 응집체가 용해되는지 확인하세요. - 최종 1ml의 부피에 700μl의 PBS를 추가합니다. PBS에서 10-7까지 연속 희석을 수행하고, 멸균 유리 구슬을 사용해 LB-1.5% 한천 플레이트에 3회 희석액 100μl을 발라.
참고: 최적의 희석 도수는 예비 실험에서 결정해야 하며, 이는 관심 있는 바이오필름 콜로니 내 세포 수와 멸균제에 대한 세포의 생존율에 따라 달라집니다. - 플레이트를 30°C에서 하룻밤 배양하고, CFU를 세어 CFU/ml를 측정합니다. 각 반 바이오필름 집락의 최종 CFU/ml에서 생존자 비율을 계산합니다.
참고: 설명한 대로 수행 및 분석하면, 대조군 바이오필름 군락의 두 절반과 처리되지 않은 생물필름 군집의 미처리 및 에탄올 처리 절반은 생존 가능한 세포 수가 10% 미만으로 나타나야 하며, 이는 각각 군집의 대칭성 또는 저항성을 검증합니다. 또는 결과를 총 CFU로 표현할 수도 있습니다. 대조군과 처리되지 않은 바이오필름 집단의 세포 수는 동일한 수준으로 유지되어야 합니다. 반면, 소분자 처리된 바이오필름 군락의 에탄올 처리된 절반의 세포 수는 멸균제에 대한 민감도를 높이기 위해 최소 두 자릿수 정도 감소할 것으로 예상됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 루리아 브로스, 레녹스 | 디프코 | 240230 | |
| 박토 아가르 | 디프코 | 214010 | |
| 인산칼륨 단염성 | 시그마, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| 인산칼륨 이염기 | 피셔 사이언티픽, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산 | 피셔 사이언티픽, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| 육수화마그네슘 클로라이드 | 머크, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| 무수칼슘 클로라이드 | J.T. 베이커, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| 망간(II) 염화사수화물 | 시그마, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| 염화철(III) 육수화물 | 시그마, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| 염화 아연 무수 | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| 티아민 염산염 | 시그마, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-트립토판 | 피셔 사이언티픽, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-페닐알라닌 | 시그마, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-트레오닌 | 시그마, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| 무수 글리세롤 | 생물학 실험실 ITD | 712022300 | |
| L-글루탐산 단나트륨 염은 수화합니다 | 시그마, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-류신 | 시그마, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| 무수 에탄올 | 가돗 | 830000054 | |
| 면도날 | 에디슨 | NA | |
| 원형 셀룰로오스 필터 페이퍼 | 왓맨, 90mm | 1001-090 | |
| 글루타알데히드 | EMS(전자미코스피 과학), 25% 수중 | 16220 | |
| 파라포름알데히드 | EMS, 16% 물에 | 15710 | |
| 나트륨 카코딜레이트 | 머크, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| 염화칼슘 2-하이드레이트 | 머크, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| 셰이커 37 °C | 뉴브런즈윅 사이언티픽 이노와42 | NA | |
| 원심분리기 | 에펜도르프 탁상용 원심분리기 5424 | NA | |
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| 인큐베이터 23 °C | 바이너 | NA | |
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