형태학적 분석을 위한 박테리아 바이오필름 군락 준비

초록

출처: Bucher, T. 외, 『B. subtilis 바이오필름 연구를 위한 소분자 바이오필름 억제제 특성화 모델로서의 방법론』. J. Vis. 경험(2016)

이 영상은 고해상도 이미징을 위해 성숙한 박테리아 바이오필름 집락을 준비하는 과정을 보여줍니다. 고정, 탈수, 장착, 금속 코팅 단계를 다루어 바이오필름 형태를 보존하고 시각화합니다.

프로토콜

주사 전자현미경을 위한 바이오필름 콜로니 샘플 준비

1. 박테리아 바이오필름 군락을 배양하세요.
2. 100 mM 카코딜레이트 나트륨, 5 mM 염화칼슘 버퍼, pH 7.3에 2%(v/v) 글루타알데히드 및 3% (v/v) 파라포름알데히드 용액을 새로 준비합니다. 직경 8.5cm의 페트리 접시 하나당 5ml의 고정제를 준비하세요.
   주의: 글루타알데히드와 파라포름알데히드는 위험합니다. 화학 후드 안에서 안전 장비를 착용해 다루세요. 유해 폐기물 내 용액과 오염된 물질을 폐기하세요.
3. 고정제를 바이오필름 군락 위에 직접 뿌리지 않고 조심스럽게 첨가하세요.
   참고: 바이오필름 군락의 소수성 특성 때문에, 군락들은 천천히 한천에서 떨어져 떠오르기 시작합니다.
4. 플레이트를 파라필름 스트립으로 조심스럽게 밀봉하세요. 로터리 셰이커에서 상온에서 2시간 배양한 후 플레이트를 4°C로 하룻밤 동안 옮깁니다.
5. 다음 날, 진공 펌프에 연결된 파스퇴르 피펫으로 액체를 조심스럽게 제거하세요.
6. 100 mM 카코딜산나트륨 100 ml와 5 mM 염화칼슘 완충제를 조심스럽게 첨가하여 바이오필름을 세척하고 5분간 배양합니다. 바이오필름 손상을 피하기 위해 플레이트 모서리에 있는 파스퇴르 유리 피펫으로 액체를 부드럽게 제거하고, 부드러운 피펫으로 신선한 세척액을 추가하세요. 이 단계를 한 번 반복하세요.
7. 바이오필름 군락의 탈수를 위해서는 다음 단계를 진행하세요: ddH₂O에서 2회 5분; 30% 에탄올에 2회 20분; 50% 에탄올에 2회 20분씩 투여; 70% 에탄올에 2회 20분씩 삽입; 96% 에탄올에 2회 20분씩 촬영; 100% 에탄올에 30분씩 2회 넣습니다.
   1. 각 단계마다 직경 8.5cm의 페트리 접시 하나당 15ml의 액체를 추가하고, 각 부화 후에는 조심스럽게 액체를 제거하세요.
8. 에탄올 샘플을 건조하는 방법은 두 가지 중 하나를 사용하세요.
   1. 에탄올에서 자연 건조하는 방법:
      1. 셀룰로오스 필터 페이퍼(직경 9cm)를 4등분으로 잘라냅니다. 1/4 1을 100% 에탄올에 잠시 담근 후, 조심스럽게 떠다니는 바이오필름 군락 하나를 옮기세요. 젖은 필터 페이퍼를 필터 페이퍼로 안감한 페트리 접시에 넣으세요. 페트리 접시를 덮고 바이오필름 군락을 화학 후드에서 하룻밤 말리게 하세요.
9. 전자현미경 스텁에 탄소 테이프를 붙여보세요. 핀셋의 도움을 받아 조심스럽게 생체막 군락을 툁 위에 옮기세요. 각 콜로니를 탄소 테이프로 만든 얇은 다리를 추가하여 스텁에 연결하는데, 이는 전자빔 아래의 전하 제거에 매우 중요합니다. 이 단계에서는 바이오필름 군락을 매우 연약하므로 조심스럽게 다루세요. 샘플은 최소 24시간 또는 검사 전까지 건조기에 보관하세요.
10. 검사 당일, 주사 전자현미경(SEM)을 사용해 금-팔라듐 스퍼터 코팅기에서 60° 각도로 바이오필름 콜로니를 2분간 스퍼터 코팅합니다. 이 과정을 두 번 반복하고 샘플을 120° 회전시킵니다. 마지막에는 샘플을 위에서 3분간 한 번 스퍼터코팅하세요. 20nm 두께의 얇은 금팔라듐층은 전도성을 높이고 주사 전자현미경에서 시료의 명암을 향상시킵니다.
11. 샘플을 건조기에 보관하여 주사 전자현미경으로 영상화할 때까지 샘플의 재수화를 방지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
무수 글리세롤	생물학 실험실 ITD	712022300
무수 에탄올	가돗	830000054
면도날	에디슨	NA
원형 셀룰로오스 필터 페이퍼	왓맨, 90mm	1001-090
글루타알데히드	EMS(전자미코스피 과학), 25% 수중	16220
파라포름알데히드	EMS, 16% 물에	15710
나트륨 카코딜레이트	머크, 214.05 g/mol	8.2067
염화칼슘 2-하이드레이트	머크, 147.02 g/mol	1172113
스텁-알루미늄 마운트	EMS, 슬롯 헤드	75230
탄소 접착 테이프	응급의료 서비스	77825-12
셰이커 37 °C	뉴브런즈윅 사이언티픽 이노와42	NA
인큐베이터 30 °C	바이너	NA
인큐베이터 23 °C	바이너	NA
로터리 셰이커 - 오비트론 로터토리 II	부켈	NA
S150 스퍼터 코팅기	에드워즈	NA
환경 주사 전자현미경	XL30 ESEM FEG 필립스 (FEI)	NA