낭포성 섬유증 환자의 가래에 의해 유도된 박테리아 바이오필름의 공초점 영상

초록

출처: Beaudoin, T. 외 챔버 커버글라스 모델을 이용한 가래가 바이오필름 형성에 미치는 영향을 시각화하기. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 환자 유래 낭포성 섬유증 가래가 박테리아 바이오필름 형성에 미치는 영향을 평가하는 시험관 내 방법을 시연합니다. 챔버 슬라이드, 형광 염색, 공초점 현미경을 사용하여 가래로 성장한 바이오필름에서 두께 증가, 구조 변화, 생존 가능한 바이오매스 증가를 밝혀내어 숙주 구성 요소가 바이오필름 발달에 미치는 역할을 강조합니다.

프로토콜

샘플 채취와 관련된 모든 절차는 기관의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

바이오필름 염색 및 정초점 현미경

1. 원하는 성장 시간(24-48시간이 가장 좋음)이 끝난 후, 챔버 웰에서 배지를 제거하고 각 챔버를 300μl 멸균 PBS로 두 번 부드럽게 세척합니다.
2. 바이오필름용 염색 혼합물을 준비하기 위해 필요한 용액 1ml당 생존 키트에 포함된 각 염료 1μl을 혼합합니다. 염료를 물이나 미디어 용액에 넣어 만들어 보세요.

참고: 물은 제조사에서 권장하는 것입니다.

3. 챔버 커버글라스 각 웰에 200μl의 염료 혼합물을 추가하고, 실온에서 어두운 환경에서 45분간 배양합니다.
4. 침착 혼합물을 챔버에서 제거하고 각 웰마다 300 μl 멸균 PBS로 세척합니다. PBS를 제거하고 신선한 물이나 배지로 교체하세요.
5. 공초점 현미경을 이용한 바이오필름 시각화를 진행하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Lab-Tek II 챔버드 커버글라스, #1.5 붕규산염, 8웰	써모 지처 사이언티브	155409
필름트레이서 라이브/데드 바이오필름 비아빌티 키트	써모피셔 사이언티브	L10316
밀러스 라인배커 브로스	써모피셔 사이언티브	12780-052	야간 고스/바이오필름 성장을 위한 표준 배지
인산염 완충 식염수 (Dulbecco A)	옥소이드	BR0014G	매체 제거 후 바이오필름 챔버의 세척
자이스 악시오베르트 200M	칼 자이스