식중성 박테리아를 이용한 제브라피시 유충의 장 감염 모델링

초록

출처: Flores, E. 외 제브라피시 유충의 식중성 감염 매개체로 원생동물 파라메시움 카우다툼을 이용하기. J. Vis. 경험 (2019년).

이 영상은 형광성 대장균에 감염된 파라미시아를 먹여 제브라피시 유충에서 식중성 박테리아 장 감염 모델을 구축하는 방법을 시연합니다.

프로토콜

1. 제브라피시의 식중독
   1. 파라미시아와 함께 박테리아를 배양하세요.
      1. 감염 전날 밤에 Paramecium caudatum 과 Escherichia coli MG1655의 공동 배양을 준비하세요. E3 배지 8mL, 진행 중인 파라미시아 배양 1mL, 대 장균 MG1655 배양 1mL(OD₆₀₀ = 1.0)를 T25 조직 배양 플라스크 1회 E3에 재현탁한 혼합 상태입니다. 플라스크는 실온(RT)에서 하룻밤 부양하세요. 각 치료 조건마다 파라미시아 플라스크 두 개를 준비하세요.
      2. 감염성 박테리아 균주(LB(용염성 육수): 1 g/L 트립톤, 0.5 g/L 효모 추출물, 1 g/L NaCl)에 멸균 접종 루프를 사용해 개별 박테리아 군락을 선별하여 접종합니다. 액체 배양물을 37°C에서 배양하고 분당 110회전(rpm)으로 하룻밤 흔들게 합니다.
         참고: 개인 보호 장비(실험실 코트와 장갑)를 착용해야 하며, 감염성 병원체를 다룰 때는 생물안전 레벨 2 시설을 사용해야 합니다.
      3. 다음 날, 야간 배양액의 OD₆₀₀ 을 측정합니다. 11mL 배지에 재현탁했을 때 OD600 1을 달성하기 위해 필요한 배양 부피를 계산합니다.
      4. 6,000 x g 에서 원심분리하여 5분간 각 파라메시아 플라스크당 1부피씩 채취합니다. 상정액을 버리고 박테리아 펠릿을 1mL E3 배지에 재현탁합니다.
      5. 선택적으로 형광 염료로 박테리아를 미리 염색해 두는 것도 좋습니다.
         1. FM 4-64FX 박테리아 염색액 1 μL (5 mg/mL 스톡 용액)을 추가합니다. 광표백을 막기 위해 튜브를 호일로 덮고, RT(상온)에서 15분간 회전시키며 배양하세요.
         2. 1x E3: 펠릿 박테리아를 6,000 x g에서 원심분리하여 1.5분간 세척하여 과잉 염료를 제거한 후, 펠릿을 1 mL의 E3 배지에 다시 현탁합니다. 세척 과정을 두 번 반복하세요.
         3. 염색된 박테리아는 6,000 x g에서 5분간 추출하여 채취합니다. 상정액을 버리고 박테리아 펠릿을 1mL E3 배지에 재현탁합니다.
      6. 신선한 파라미시아 플라스크 두 개 각각에 박테리아 현탁액 1mL를 추가하세요. RT에서 2시간 정도 부양하세요.
         참고: 염색된 박테리아를 다룰 경우, RT에서 어두운 환경에서 2시간 배양하세요
2. 세척 박테리아/파라미시아 공동 배양
   1. 두 플라스크의 파라미시아/박테리아 공동 배양 플라스크의 내용을 50mL 원뿔형 튜브에 합칩니다. 원심분리기는 300 x g , 15 °C에서 10분간 샘플링합니다. 이 단계 전에 원심분리기가 미리 냉각되었는지 확인하세요.
   2. 혈청학적 피펫으로 약 10mL의 E3 상청액을 제거하고, 원뿔 튜브에 신선한 1x E3 약 10mL를 추가합니다.
      참고: 모든 세척 단계에서 상정액을 제거할 때는 매우 빠르게 해야 하며, 파라메시아가 펠릿 밖으로 헤엄쳐 나오기 시작합니다. 이 단계에서 빠르게 처리하고 상액 손실을 방지하기 위해 한 튜브씩 돌려 제거하세요.
   3. 300 x g 원심분리 , 15 °C에서 5분간 샘플을 돌립니다. 혈청학적 피펫으로 약 10mL의 E3 상청액을 제거하고, 원뿔 튜브에 신선한 1x E3 약 10mL를 추가합니다. 이 단계를 두 번 반복하세요.
   4. 원심분리기는 300 x g 압력에서 15 °C에서 5분간 샘플링합니다. 약 10mL의 E3 상청액을 제거하되, 펠릿을 손상시키지 않도록 주의하세요.
   5. 남은 10mL의 E3 배지에 펠릿을 재현탁하고, 500 μL의 현탁액을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 500 μL 파라미시아를 300 x g 에서 원심분리하여 5분간 파라미시아 개체 수를 세어 펠릿으로 넣습니다.
   6. 500 μL 샘플에서 E3 상원액 400 μL를 제거합니다. 남은 100 μL 파라미시아에 36.5% 포름알데히드 용액 20 μL를 추가하고 부드럽게 재현탁한 후 22 °C에서 5분간 배양합니다.
      참고: 이 단계는 파라미시아를 죽여 세기를 가능하게 합니다.
   7. 피펫을 사용해 실제 총 부피를 측정하고 기록하세요. 파라미시아 현탁액을 0.4% 트라이판 블루 용액으로 1:1 v/v 희석하세요.
   8. 세포 계수기나 혈구계를 사용해 죽은 파라미시아 수/mL 수를 세세요.
      참고: 이전 고정 단계 때문에 대부분의 파라메시아는 이 시점에서 죽었지만, 이 수치는 공동 인큐베이션 실험용 살아있는 파라미시아 수를 반영합니다. 저자들은 박테리아 공동 인큐베이션으로 인한 유의미한 파라메시아 사망을 발견하지 못하므로, 이 점은 여기서 고려하지 않아도 된다.
3. 파라미시아와 제브라피시 유충을 공동 품게 한다
   1. 50mL 원뿔관 내 파라미시아 농도를 계산하세요
   2. 최종 부피 3 E3 중 2 x 10⁵ paramecia/mL 농도에 필요한 세척된 파라미시아의 부피를 계산합니다.
      참고: 파라미시아의 농도는 원하는 박테리아 용량에 따라 조절할 수 있으며, 이는 최적화 대상입니다.
   3. 100 mM Tris pH 8.0에 트리카인을 최종 농도 100 mg/L로 첨가하여 마취합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 10마리의 제브라피시를 적절한 농도의 신선한 E3 3mL에 옮깁니다. 유충은 최소한의 양의 액체로 옮겨져 수혜자가 마취에서 회복할 수 있도록 해야 합니다.
   4. 먹이를 잡기에 최적의 조명 조건을 위해 주간 인큐베이터에서 30°C에서 2시간 동안 부화하세요.
   5. 제브라피시는 최소 5번 세척하여 신선한 E3 3mL를 새 우물에 옮기고, 각 웰에 100 mg/L 트리카인을 넣어 세척하세요.
      참고: 세척 단계에서 트리카인을 빼려고 하지 마세요. 마취 없이 이동 중인 유충을 옮기는 것은 동물에게 손상과 고통의 위험을 높입니다.
   6. 선택적으로, 검은 벽의 6웰 플레이트에 1% 저융 아가로스 3mL를 삽입하여 제브라피쉬를 영상 촬영을 위해 준비할 수 있습니다: 저융 아가로스는 1xE3로 만들어 전자레인지에서 가열합니다. 녹으면 트리카인을 최종 농도인 160 mg/mL로 첨가합니다. 입체현미경 아래에 위치시키고, 잘린 젤 로딩 팁을 사용해 머리가 왼쪽에 있고 꼬리가 오른쪽에 있는지 확인하세요(그림 1). 아가로스가 굳을 때까지 5분간 기다린 후, 삽입된 생선에 160 mg/mL 트리카인이 들어 있는 1x E3를 겹쳐 영상 촬영을 합니다.

결과

그림 1: 제브라피시의 박테리아 정착. 5 dpf 상태의 얼룩말피시는 감염되지 않았거나(A) 또는 (B) E. coli 또는 (C) Salmonella enterica 를 발현하는 mCherry로 집락화되었습니다. 감염 실험은 야생형(A , B) 어류...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파라미시움 카우다툼, 생방송	캐롤라이나	131554	아니요, 키우는 배양물을 실온 이하로 보관하지 마세요
0.4% 트라이판 블루 용액	시그마	T8154-20ML	액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합함; 0.81% 염화나트륨과 0.06% 인산칼륨으로 디베이스로 제조되었습니다
디메틸 설폭사이드 (DMSO)	시그마	276855-100ML	용제 안전 캐비닛에 보관하세요
대장균, MG1655	ATCC	ATCC 700926	다른 비병원성 대장균으로 대체할 수 있습니다
FM 4-64FX 스테인	써모피셔	F34653	얼리코트와 스토어 냉동
포름알데히드	시그마	F8775-4X25ML
LB 브로스	시그마	L3397-1KG
인산염 완충 식염수 정제	써모피셔	18912014
테트라사이클린	시그마	87128-25G	독성, 자극성
트리카인 (에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트)	시그마	E10521-10G
트리톤 X-100	시그마	X100-100ML
트리판 블루 솔루션, 0.4%	시그마	93595-50ML
울트라퓨어 저융점 아가로스	써모피셔	16520050
혈구계 또는 세포 계수기	어떤
입체 현미경	어떤
탁상형 원심분리기
마이크로파
회전 바퀴
가열 흔들기 인큐베이터
수상 시설
번식 탱크