전기화학 반응기를 이용한 박테리아 단층 바이오필름 개발

초록

출처: Tokunou, Y. 외, Shewanella oneidensis MR-1에서 세포 외부 전자 전달에 미치는 중수소 동위원소 효과의 전기화학적 검출. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 전극 표면에서 바이오필름 형성을 시뮬레이션하기 위해 설계된 전기화학 반응기 모델의 조립 및 작동을 시연합니다. 제어된 전기화학 자극은 미생물 부착을 촉진하여 박테리아 단일층 바이오필름의 점진적 발달로 이어집니다.

프로토콜

1. 3전극 전기화학 반응기의 구조 (그림 1)
   1. 원자로 바닥에 인듐 주석 도핑 산화물(ITO) 기판을 작동 전극으로 배치하세요.
   2. 그 후 직경 2cm의 유리 실린더와 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 덮개를 삽입합니다. 그 다음 은/염화은(Ag/AgCl)(염화칼륨, KCl 포화)과 백금선을 각각 기준 전극과 대응 전극으로 삽입합니다.
      참고: 공기와 용액의 누출을 방지하기 위해 각 부품 사이에 부틸 고무 시트를 삽입하세요.
   3. 10 mM 락테이트와 0.5 g/L 효모 추출물을 보충한 정의 배지(DM) 4.0mL를 전기화학 반응기에 첨가합니다.
   4. 전기화학 반응기에서 누출이 없음을 확인한 후, 질소 가스를 20분 동안 전기화학 반응기에 유입하여 전기화학 반응기 내부 혐기 상태를 유지합니다.
      참고: 다른 미생물과의 오염을 방지하기 위해, 가스는 전기화학 반응기로 들어가기 전에 필터링되어야 합니다.
   5. 전기화학 반응기를 포텐티오스탯에 연결하고, 표준 수소 전극(SHE)과 비교해 +0.4 V를 ITO 전극에 인가하여 외부 수순환 시스템을 이용해 전기화학 반응기 온도를 30 °C로 유지합니다.
      참고: 외부 전기장의 영향을 방지하기 위해 전기화학 반응기는 패러데이 케이지에 배치되어야 합니다.
2. S. oneidensis MR-1 세포의 전기화학적 배양 (그림 1 및 그림 2)
   1. 1.1단계에서 얻은 부탁액의 세포 밀도를 600nm에서 광학 밀도 1.43(OD₆₀₀)으로 조정하고, DM에는 10 mM 락테이트와 0.5 g/L 효모 추출물을 보완합니다.
      참고: 정확한 OD₆₀₀을 얻으려면, OD₆₀₀을 1.43으로 조정하기 전에 UV-vis 분광기에 ≤ OD₆₀₀의 셀 현탁액을 적용하세요.
   2. 주사기를 사용해 주입 포트를 통해 전기화학 반응기에 0.3mL의 셀 현탁액을 주입하면, 반응기 내 OD₆₀₀ 이 0.1로 변합니다.
      참고: OD₆₀₀ = 1.43의 0.3 mL 세포 현탁액을 4.0 mL 배지를 포함한 전기화학 반응기에 첨가하면 OD₆₀₀ = 0.1인 4.3 mL의 용액이 생성됩니다. 다른 부피의 원자로를 사용할 때는 셀 밀도 계산이 필요합니다.
   3. +0.4 V(SHE와 비교)로 ITO 전극에 25시간 동안 전위를 계속 가하세요.
      참고: ITO 전극에 단일층 바이오필름이 형성될 때, 생성된 전류가 그림 2에서 50% 미만의 편차를 보이도록 해야 합니다.

결과

그림 1: 이 연구에 사용된 전기화학 반응기. 전기화학 전지의 시공 전(a)과 시공 후(b) 사진. (c) +0.4 V 전압에서 25시간 전기화학 접종 후 전기화학 반응기와 SHE의 도식.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유리 실린더	해당 없음	해당 없음	맞춤 제작, 전기화학 반응기로 사용됨
PTFE 커버와 베이스	해당 없음	해당 없음	맞춤 제작, 전기화학 반응기의 덮개와 기초로 사용됨
부틸 고무	해당 없음	해당 없음	전기화학 반응기의 각 구성 요소 사이에 삽입된 맞춤 제작
셉타	GL 사이언스	3007-16101	전기화학 반응기의 주입 포트로 사용
인듐 주석 도핑 산화물(ITO) 전극	지오마텍	번호 0001	작동 전극으로 사용, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl 포화 전극	호쿠토 덴코	HX-R5	기준 전극으로 사용됨, Φ0.30mm
백금 와이어	닐라코 협동조합	PT-351325	카운터 전극으로 사용
루리아-베르타니 (LB) 브로스, 밀러	벡턴, 디치킨슨 앤 컴퍼니	244620	S. oneidensis MR-1 사전 배양용 배지
백토 한천	벡턴, 디치킨슨 앤 컴퍼니	214010
NaHCO₃	와코	191-01305	정의 매체(DM)에 사용됨
CaCl₂·2H₂O	와코	031-00435	DM용으로 사용
NH₄Cl	와코	011-03015	DM용으로 사용
MgCl₂·6H₂O	와코	135-00165	DM용으로 사용
나클	와코	191-01665	DM용으로 사용
2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라자닐] 에탄설폰산 (HEPES)	도진도	346-08235	DM용으로 사용
낙산나트륨 용액	와코	195-02305
박토효모 추출물	벡턴, 디치킨슨 앤 컴퍼니	212750
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