GFP 태그 SKN-1을 이용한 C. elegans 의 병원체 유발 산화 스트레스 시각화

초록

출처: 나지, A. 외. 카에노르합디티스 엘레간스에서 미티스군 연쇄상구균에 의해 유발되는 산화 스트레스 연구. J. Vis. 경험 (2019)

이 영상은 C. elegans에서 녹색 형광 단백질 표지 SKN-1을 사용해 산화 스트레스를 모니터링하기 위해 녹색 형광을 추적하는 방법을 보여줍니다. S. gordonii 에 노출된 벌레는 강한 핵 형광을 보여 병원체 유발 스트레스를 확인시킴으로, 대 장균 을 먹인 벌레는 세포질에서 확산된 녹색 형광을 보여 SKN-1 활성화가 최소화됨을 나타냅니다.

프로토콜

1. 연쇄상구균 고르도니이 감염에 대한 반응에서 SKN-1 위치 관찰

1. 연쇄상구균을 씨앗한 Todd–Hewitt 효모 추출물(THY)과 대장균(E. coli)을 씨앗한 선충 성장 배지(NGM) 한천판에 1~100 L4 유충을 추가합니다 . 박테리아 균주당 세 개의 플레이트를 사용하세요. 플레이트를 25°C에서 2시간에서 3시간 정도 배양하세요.
2. 그 후 인큐베이터에서 플레이트를 분리하고, 변형된 M9 버퍼(M9W)로 세척한 후 15mL 원뿔형 튜브에 벌레를 수집합니다.
3. 지렁이를 3번 씻어주세요.
4. 흡입으로 대부분의 M9W를 제거하고, 2 mM 아지드 나트륨 또는 2 mM 테트라미솔 염산염 함유 500 μL M9W를 웜 펠릿에 첨가합니다. 이 방법은 벌레를 마취하여 현미경으로 촬영할 때 움직임이 없도록 보장합니다.
   주의: 아지드나트륨을 다룰 때는 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요. 화학 후드 아래에서 아지드 용액을 준비하세요.
5. 지렁이 펠릿은 실온(RT)에서 15분간 부화하세요. 그 다음, 15 μL 부유액을 준비된 진천당 패드에 붙입니다. 마취된 기생충이 들어있는 아가로스 패드 위에 No. 1.5 커버슬립을 부드럽게 덮어주세요.
6. 형광 현미경을 사용해 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 필터를 이용해 스킨헤드 패밀리 전사 인자 1 또는 SKN-1:GFP(녹색 형광 단백질 표지 SKN-1)의 위치를 시각화합니다. 이미지 웜은 10배, 20배 배율로 나타납니다.
7. SKN-1의 국소화 수준을 기준으로 벌레 점수를 매기세요. 핵 위치 없음, SKN-1B/C::GFP(녹색 형광 단백질 표지 SKN-1 아이소폼 B/C)의 전방 또는 후방 위치, 그리고 모든 장 세포에서의 SKN-1B/C::GFP의 핵 위치 위치는 각각 저, 중, 고수준으로 분류됩니다.
8. 형광 현미경 사진을 채점한 후, 통계 소프트웨어를 사용해 카이제곱과 피셔 정확 검정을 통해 통계적 차이를 산출합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
매체 및 화학물질
BD 백토 토드 휴잇 육수	피셔 사이언티브	DF0492-17-6
15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리관	피셔 사이언티브	12-565-269
아자이드나트륨	시그마 올드리치	S2002-25G
테트라미솔 하이드로클로라이드	시그마 올드리치	L9756
No.1.5 18mm x 18mm 커버 슬립	피셔 사이언티브	12-541A
아가로스	시그마 올드리치	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + ROL-6(SU1006)	키스 블랙웰