광감감제 전구체를 이용한 박테리아 바이오필름의 광 활성화 처리

초록

출처: 자오, K. 외 5-아미놀레불린산 매개 광역학 치료가 황색포도상구균 바이오필름에 미치는 영향을 연구하기 위한 시험관 내 모델. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 그람 양성 박테리아 바이오필름에 대한 항균 효과를 평가하는 광역학 치료 프로토콜을 시연합니다. 바이오필름은 네 그룹으로 나뉩니다: 두 그룹은 광감성 전구체를, 두 그룹은 완충제를 받습니다. 모든 종은 어두운 환경에서 배양되며, 이후 전구체 처리된 그룹과 완충 단독 그룹에 적색광 노출을 합니다. 반응성 산소 종은 전구체와 빛을 모두 받는 그룹에서만 생성되어 박테리아 세포 사멸을 초래합니다. 치료 효능을 평가하기 위해 모든 그룹에서 생존 가능성을 비교합니다.

프로토콜

1. 바이오필름 형성

1. 96웰 마이크로플레이트에서의 바이오필름 형성
   1. 황 색포도상구균 균주(USA300)와 -80°C에 보관된 3종의 바이오필름 형성 임상 균주(C1-C3)를 회수하세요.
      참고: 임상 균주가 바이오필름을 형성하는 능력은 미세타이터 플레이트 분석법을 통해 결정되었습니다.
   2. 박테리아를 5mL 트립톤 대두육수(TSB) 배지에 접종하고, 37°C에서 진동하며 인큐베이터에서 하룻밤 동안 정지 상태로 배양합니다.
   3. 박테리아 배양물을 4,000 × g에서 25°C에서 10분간 하룻밤 원심분리한 후 상원액을 버립니다. 이 펠릿을 인산염 완충식염수(PBS)에 재현탁하여 최종 농도는 2.0 ×^{10 9} 콜로니 형성 단위(CFU)/mL로 만듭니다.
      참고: 박테리아 농도는 광학 밀도를 측정하고 판 수로 추가 측정하여 1 OD₆₀₀ 현탁액에 1.5 ×⁸ CFU/mL를 포함함으로 확인했습니다.
   4. 박테리아 현탁액을 0.5% 포도당을 포함한 TSB 배지에 1:200(1.0 ×¹⁰ 7 CFU/mL)으로 희석합니다. 세포 배양 처리된 폴리스티렌 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 200 μL의 박테리아 현탁액을 접종합니다.
   5. 마이크로플레이트를 37°C에서 산소가 풍부한 환경에서 24시간 동안 정적으로 배양합니다.
      참고: 성숙한 바이오필름 형성의 배열 시간은 박테리아 균주에 따라 다를 수 있습니다; 이는 광역학 치료(PDT) 실험 전에 결정되어야 합니다.
   6. 웰 내 배지를 버리고 마이크로플레이트 웰을 PBS로 세 번 부드럽게 세척한 후 상원액을 버립니다.
      참고: 이 단계는 형성된 바이오필름을 손상시키지 않도록 매우 부드럽게 진행해야 합니다.

2. 광 조사

1. 5-아미놀레불린산(5-ALA)은 4°C 냉장고에 보관하세요. 실험 전에 5-ALA를 PBS와 희석하여 10 mM으로 희석합니다.
   참고: 5-ALA 용액은 실험 전에 신선하게 준비해야 합니다.
2. 실험군에서는 마이크로플레이트의 각 웰에 10 mM ALA 200 μL 또는 배양 접시에 2mL를 추가합니다. 접시나 접시를 알루미늄 호일로 덮고 1시간 동안 부화시키세요. 그 다음, 100 mW/cm² 의 빛 강도를 가진 발광 다이오드(LED)로 판/접시를 1시간 동안 照射하여 633 ± 10 nm 주요 파장에서 360 J/cm² 의 빛 선량을 달성합니다.
   참고: 모든 우물/접시에서 빛 에너지가 바이오필름에 효과적이고 균등하게 전달되도록, 광원의 꼭대기에서 우물/접시까지의 거리를 6.0cm로 고정하고, 실험 영역을 중심 조사 영역(10cm × 8cm)으로 제한합니다. 결과가 재현 가능하도록 하기 위해서는 동일한 실온에서 실험을 수행해야 합니다. LED 조사 단계에서는 플레이트가 햇빛, 실내 조명, 램프 등 다른 광원에 직접 노출되지 않도록 플레이트를 켜고 플레이트/접시를 조사 구역으로 이동시키기 전에 LED를 켰고, 빛이 작업을 마칠 만큼 밝았습니다.
3. 대조군을 설정했습니다(우리 실험에서는 세 개의 대조군이 있었습니다).
   1. 첫 번째 대조군(ALA-LED-)의 경우, 마이크로플레이트의 각 웰에 200 μL PBS 또는 배양 접시에 2 mL를 추가합니다. 접시/접시를 알루미늄 호일로 덮고 2시간 동안 부화시키세요.
   2. 두 번째 대조군(ALA+LED-)의 경우, 마이크로플레이트의 각 웰에 10 mM ALA 200 μL 또는 배양 접시에 2 mL를 첨가합니다. 접시/접시를 알루미늄 호일로 덮고 2시간 동안 부화시키세요.
   3. 세 번째 대조군(ALA-LED+)의 경우, 마이크로플레이트의 각 웰에 200 μL PBS 또는 배양 접시에 2 mL를 추가합니다. 접시/접시를 알루미늄 호일로 덮고 1시간 동안 부화시키세요. 그 다음, 360 J/^{cm 2} 빛 복사를 633 ± 10 nm의 주요 파장으로 LED에 노출시킵니다.
      참고: LED 조사 단계에서는 플레이트가 햇빛, 실내 조명, 램프 조명과 같은 다른 광원에 직접 노출되는 것을 피해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립톤 간장 육수 (TSB)	옥소이드	CM0129B
시토9	써모피셔 사이언티브	L7012	LIVE/DEAD BacLight 박테리아 생존 키트
프로피듐 요오다이드 (PI)	써모피셔 사이언티브	L7012	LIVE/DEAD BacLight 박테리아 생존 키트
5-아미놀레불린산 (ALA)	푸단장장 바이오제약	3.1
황색포도상구균 균주 USA300			USA 300 참고 자료
황색포도상구균 임상 균주 (C1-C3)			모든 임상 균주는 만성 비비동염 환자로부터 분리하였다
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