형광 표지 박테리아의 샘플 준비 및 영상

초록

출처: Chetrit, D. 외 레 지오넬라 폐포균 DOT/ICM 분비계의 시공간적 특징을 해명하기 위해 생세포 영상 및 냉동 전자 단층촬영 적용. J. Vis. 경험 (2020).

이 영상은 형광 표지된 병원성 박테리아의 준비와 영상 촬영 과정을 시연합니다. 아가로스 패드는 먼저 접착 프레임 안에 준비되어 위치시킵니다. 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아의 현탁액을 패드에 적용하여 세포를 고정시킵니다. 프레임은 커버슬립으로 밀봉되어 현미경으로 관찰하여 박테리아의 형광 이미지를 포착합니다.

프로토콜

참고: L. neumophila 의 성장, 조작 및 영상 촬영과 관련된 모든 절차는 지역 지침을 준수하는 생물학적 안전성 2단계 실험실에서 수행되어야 합니다.

1. 레지오넬라 폐렴구 염색체에 대립유전자 교환 및 이중 선택 전략을 이용한 sfGFP 삽입 (그림 1, 그림 2)

1. 유전자 치환 벡터 pSR47S11에 다음 서열을 복제합니다: 관심 부위의 상류 1,000 bp, 그 다음 sfGFP 서열, 그리고 관심 부위의 하류 1,000 bp(그림 1). sfGFP 서열은 N-말단 또는 C-말단 끝에 4개에서 8개의 아미노산을 포함하는 링커와 함께 프레임에 배치해야 합니다. 생성된 벡터를 대 장균(Escherichia coli DH5αλpir)으로 변환합니다. 이후에는 100 μg/mL 스트렙토마이신이 함유된 숯효모 추출물(CYE) 한천에서 단일 군락을 형성하는 L. pneumophila 를 스트릭 스트릭으로 삼아 37°C에서 5일간 증육합니다(그림 2).
2. 스트릭 L. 폐오모필라 가 CYE-아가-스트렙토마이신을 복용해 37°C에서 2일간 자라며(강한....

결과

그림 1: SfGFP를 L. pneumophila 염색체 에 삽입하는 데 사용된 상동 재조합 및 대립유전자 교환의 개요.(A) 접합성 플라스미드 pRK600(IncP 플라스미드)을 보유한 대장균 MT616 보조 균주, 자살 벡터 pSR47S로 변형된 기증 대장균주, 그리고 수혜자인 L. pneumophila 간에 삼부모 교배가 이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100배 계획 Apo 목표 (1.4 NA)	니콘
에이스	시그마-올드리치	A9758
활성탄	시그마-올드리치	C5510
아가로스 GPG/LMP, 저녹임	미국 생물분석	AB00981
백토 탈수 한천	BD	214010
유전자 프레임, 1.7x2.8 cm, 125 μL	피셔 사이언티브	AB-0578
L-시스테인	시그마-올드리치	C7352
현미경 커버 슬라이드 22x22 mm	피셔 사이언티브	12-542B
현미경 커버 슬라이드 24x50 mm	피셔 사이언티브	12-545K
현미경 슬라이드 25x75x1 mm	글로브 사이언티픽	1380
슬라이드북 6.0	지능형 영상 혁신
스펙트라 X 라이트 엔진	루멘코어
Taq 2X 마스터 믹스	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0270
타이탄 크리오스	써모피셔 사이언티브
효모 추출물	BD	212750