참고: L. neumophila 의 성장, 조작 및 영상 촬영과 관련된 모든 절차는 지역 지침을 준수하는 생물학적 안전성 2단계 실험실에서 수행되어야 합니다.
1. 레지오넬라 폐렴구 염색체에 대립유전자 교환 및 이중 선택 전략을 이용한 sfGFP 삽입 (그림 1, 그림 2)
- 유전자 치환 벡터 pSR47S11에 다음 서열을 복제합니다: 관심 부위의 상류 1,000 bp, 그 다음 sfGFP 서열, 그리고 관심 부위의 하류 1,000 bp(그림 1). sfGFP 서열은 N-말단 또는 C-말단 끝에 4개에서 8개의 아미노산을 포함하는 링커와 함께 프레임에 배치해야 합니다. 생성된 벡터를 대 장균(Escherichia coli DH5αλpir)으로 변환합니다. 이후에는 100 μg/mL 스트렙토마이신이 함유된 숯효모 추출물(CYE) 한천에서 단일 군락을 형성하는 L. pneumophila 를 스트릭 스트릭으로 삼아 37°C에서 5일간 증육합니다(그림 2).
- 스트릭 L. 폐오모필라 가 CYE-아가-스트렙토마이신을 복용해 37°C에서 2일간 자라며(강한 부위). 스트릭 E. coli DH5α는 LB 한천에서 pRK600 보조 플라스미드(보조 플라스미드)와 함께 형질전환하여 25 μg/mL 클로람페니콜을 함유하고 있습니다. 50 μg/mL 카나마이신이 포함된 LB 한천에 대 장균 DH5αλpir(기증자)를 스트릭합니다.
- 삼부모 교배를 수행: 세 균주의 패치를 CYE 한천 플레이트에 겹쳐 37°C에서 4–8시간 배양하여 도우미, 기증자, 수혜자의 군집을 배양합니다. 음성 대조군으로는 도우미+수혜자 균주 혼합과 기증자+수혜자 균주 혼합을 같은 기간 인큐베이팅합니다.
- 교합 반응을 500 μL ddH2O에 재현탁하고, 100 μg/mL 스트렙토마이신과 10 μg/mL 카나마이신을 함유한 CYE 한천에 20 μL과 50 μL 반응을 배양하여 37 °C에서 5일간 증육합니다. 결과 클론 4개를 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 CYE 한천에 연쇄 연쇄하여 37 °C에서 5일간 성장시킵니다.
- 5% 자당과 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함한 CYE 한천에 16개의 클론을 연속하여 37 °C에서 5일간 배양합니다. 그 다음, 100 μg/mL 스트렙토마이신이 함유된 CYE 한천과 100 μg/mL 스트렙토마이신, 10 μg/mL 카나마이신이 함유된 CYE 한천에 32개의 클론을 연속하여 37°C에서 5일간 증육합니다.
2. L. 폐실염색체에 sfGFP를 통합한 클론 분리
- CYE-아가-스트렙토마이신 배지에서 카나마이신에 민감한 스트릭 클론은 콜로니 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 염색체에 sfGFP가 삽입된 것을 확인했습니다. sfGFP 유전자와 관심 염색체 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 삽입 접합부를 증폭시킵니다.
- 10 μM 프라이머 용액 각각과 1개의 콜로니를 각각 0.5 μL씩 혼합하여 최종 부피 12.5 μL로 만들고 95 °C에서 10분간 변성시킵니다. 얼음 위에 10분간 식힌 후 2개의 PCR 마스터 믹스 용액 12.5 μL 추가한 후 PCR 분석을 수행합니다.
- 분리된 콜로니의 무거운 부위를 CYE-아가-스트렙토마이신 플레이트에 37°C에서 2일간 배양합니다. 항GFP 항체로 면역블롯하여 sfGFP 융합의 발현 수준과 안정성을 검사합니다.
3. 형광 태그된 Dot/ICM 성분을 가진 L. 폐포균의 생세포 영상
- 아가로스 패드 준비
- 1% 저융 아가로오스 용액을 약 30mL 물에 담가하세요. 유리 플라스크에 전자레인지에 약 90초간 돌리면서 가끔씩 돌려 아가로오스가 완전히 녹을 때까지 돌립니다.
- 25 x 75 x 1.1mm3 유리 슬라이드 가장자리에 22 x 22 x 0.15 mm 3 유리 슬라이드 두 장을 겹쳐 놓으세요. 반대쪽 가장자리에는 22 x 22 x 0.15mm 유리 슬라이드 3개를 더 쌓으세요.
- 용융된 아가로스 약 1mL를 두 상단 유리 슬라이드 사이 중앙 슬라이드에 피펫팅한 후, 용융 아가로스 위에 25 x 75 x 1.1mm 3 슬라이드를 추가로 올립니다. 기포가 생기지 않도록 주의하세요. 슬라이드를 4°C에서 15분간 식힙니다.
- 메스나 면도날을 사용해 패드를 작은 정사각형으로 부드럽게 자르세요, ~5 x 5 mm2. 25 x 75 x 1.1mm 3 유리 슬라이드에 양면 접착 17 x 28 x 0.25mm 3 프레임을 고정하고, 슬라이드에 여러 패드를 붙입니다.
- 이미지 획득
참고: 다음 단계는 SlideBook 6.0의 제어 하에 있는 현미경에 대해 설명되었으며, 고체 상태 조명기, CCD 단색 카메라, 100배 대물렌즈(1.4 수치 조리개)가 장착되어 있습니다. 필요하다면 프로토콜 설정에 따라 맞춤 설정할 수 있는 적절한 하드웨어 및 소프트웨어 구성을 갖춘 대체 현미경 장치를 사용하세요.- L . 폐기균 의 무거운 패치를 ddH2O 1 mL에 녹이고, 2–3 μL 희석액을 피펫으로 돌려 패드에 사용한다. 50 x 24 x 0.15mm 3 커버슬립을 접착 프레임 위에 부드럽게 올려놓으세요.
- 캡처 창에서 ND를 180으로 조정하세요. 빈 비율을 2×2로 조정하고 488 nm 채널을 사용해 500–1,000ms 사이에 샘플을 노출하세요. 동일한 매개변수로 태그되지 않은 L. pneumophila 영상을 사용하여 형광 신호의 특이성을 검증합니다(그림 3).
