클로스트리듐 디피실 감염의 마우스 모델 구축

초록

출처: 윈스턴, J. A. 외 임상적으로 중요한 Clostridium difficile 균주 R20291의 Cefoperazone 처리 마우스 모델. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 항생제 사전 처리된 쥐에게 클로스트리듐 디피실 포자를 접종하여 병원 및 숙주 반응 연구를 위한 쥐 감염 모델을 구축하는 절차를 시연합니다.

프로토콜

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 클로스트리듐 디피실 포자 접종 및 마우스 구강 관구 제제

참고: C. difficile 포자에 감염된 쥐는 생물안전 레벨 2 동물 시설에 보관되어야 합니다.

1. 원하는 품종(이 경우 R20291)의 C. difficile 포자 재고를 4°C에서 멸균수에 저장하여 준비합니다. 사용 전에 이 포자 재고의 열거 수를 결정하세요.
2. 알려진 포자 농도(포자당 ml)를 바탕으로 25 μl당 10⁵ 포자를 얻기 위해 원하는 희석도를 계산합니다. 접종량이 실험 내 모든 마우스에 접종할 수 있을 만큼 충분한지 확인하고(마우스당 25 μl), 접종 수량 측정(약 30 μl), 피펫 오차를 고려할 수 있도록 합니다.
3. 원래의 C. 디피실 포자 자재 소용돌이. 그 후, 1.2단계에서 계산된 원래 C. difficile 포자 재고의 부피를 나사 캡이 달린 마이크로 원심분리기 튜브 안의 멸균수에 재현탁합니다. 이 작업을 라미너 플로우 후드에서 유산소로 수행하세요. 이 희석된 혼합물을 '포자 접종체'라고 식별하세요.
4. 포자 접종체를 65°C 물욕에 넣고 20분간 가열하세요.
   참고: 이 단계는 열처리 후 활성 C. difficile 포자만 남도록 보장합니다.
5. 층류 후드 내에서 가열한 포자 접종체 50μl를 취해 멸균 마이크로 원심분리기에 넣은 후 혐기성 챔버로 통과시킵니다. 이 샘플을 포자 열거에 사용하세요.
6. 층류 후드 내에서 남은 가열된 포자 접종물을 멸균 구형 끝 위 개비지 바늘에 부착한 1ml 주사기에 주입합니다. 수동 주사기 스테퍼를 사용해 마우스 간에 정확하고 빠른 반복 투여를 보장하세요. 사용 전에 가비지 바늘에 가열된 포자 접종제가 채워져 있는지 확인하세요.
   참고: 각 쥐마다 새로운 멸균 주사기를 사용할 필요는 없습니다. 하지만 다양한 용량의 C. difficile 포자를 투여할 경우, 각 투여마다 새로운 가비지 바늘을 권장합니다.
   참고: C. difficile 포자는 전통적인 소독제에 매우 저항성이 높습니다. 따라서 #62 Perisept 포자 살균 소독제와 같은 포자 살균제 사용이 필요합니다. 제조사는 C. difficile 포자를 파괴하기 위해 2분 정도 접촉 시간을 권장합니다.
7. 각 쥐에게 포자 접종량 25μl을 가베지합니다. 목과 등 뒤의 느슨한 피부를 잡아 머리를 움직이지 못하게 하여 쥐를 부드럽게 제압하세요. 검지로 사용하면 동물의 머리를 더욱 고정시키고 식도를 길게 만듭니다. 동물이 제압 중에 소리를 내거나 다른 고통의 징후를 보이지 않도록 주의하세요.
   참고: 가베지로 쥐에게 주는 총 양은 체중 10ml/kg(0.1ml/10g)을 초과해서는 안 됩니다.
8. 쥐를 똑바로 세운 상태로 유지한 후 가비지 바늘을 입 옆에 부드럽게 넣으세요. 개비지 바늘을 입천장을 따라 방향을 잡고 천천히 식도 안으로 밀어 넣으세요.
   참고: 저항이 있으면 관속 바늘이 기관에 들어가고 있을 수 있으므로, 바늘을 앞으로 밀어내지 않고 즉시 제거하고 재배치해야 합니다.
9. 관개 바늘이 식도 중간쯤 들어간 후 가열한 포자 접종 25 μl을 주입하고 부드럽게 식도에서 빼냅니다.
   참고: 가비지 바늘을 강하게 밀어붙이면 식도나 위 파열이 발생할 수 있습니다. 따라서 개비지 바늘을 전진할 때 저항이 발생하면 즉시 가비지 바늘을 제거하고 재배치하는 것이 가장 좋습니다.
10. 동물을 다시 우리에 넣고 기침이나 호흡 곤란 징후가 있는지 관찰하세요. 이는 기관 주입 부실이나 가열된 포자 접종 흡인을 나타낼 수 있습니다.
    참고: 생쥐는 항생제 치료 후 C. difficile 에 매우 취약합니다; 따라서 우리 간 교차 오염을 방지하기 위한 예방 조치가 필수적입니다. 이는 특히 항생제 치료를 받았지만 도전받지 않은 쥐를 대조군으로 관리할 때 중요합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
#62 페리셉트 스포디셜 소독제	SSS 내비게이터	48027	이 제품은 제조사에서 권장하는 희석이 필요합니다
C57BL/6J 마우스	잭슨 연구소	664	쥐는 5주에서 8주 정도여야 합니다
2ml 마이크로 원심분리기 스크류 캡	코닝	430917