방법 논문

감염된 마우스 모델의 대변 샘플에서 클 로스트리듐 디피실 정량화

2026년 3월 31일

이 논문에서

초록

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출처: 윈스턴, J. A. 외 임상적으로 중요한 Clostridium difficile 균주 R20291의 Cefoperazone 처리 마우스 모델. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 감염된 마우스 모델의 대변 샘플에서 선택적 배양 기법을 사용하여 클 로스트리듐 디피실 을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 샘플 수집, 혐기성 처리, 연속 희석, 군체 개체 수 절차를 개략적으로 제시하여 박테리아 정착과 숙주-병원체 상호작용을 평가합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

  1. 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 열거를 위한 샘플 채 취
    참고: 대변이나 맹장 성분을 채취하기 전에 멸균 마이크로 원심분리관을 분석 저울로 측정하세요. 튜브 측면에 튜브 무게를 소수점 4자리(예: 0.9864 g)까지 반올림하여 기록합니다. 이 무게를 "튜브 무게"라고 부릅니다. 채취된 모든 샘플은 멸균되고 무게가 측정된 마이크로 원심분리관에 보관되어야 합니다.
    1. 쥐 배설물의 멸균 수집
    1. 목과 등 뒤의 느슨한 피부를 잡아 쥐를 부드럽게 고정시켜 머리를 고정시키세요. 새끼손가락으로 꼬리를 부드럽게 묶어 항문을 노출시키세요. 동물이 제압 중에 소리를 내거나 다른 고통의 징후를 보이지 않도록 주의하세요.
    2. 멸균된 무게가 측정된 마이크로 원심분리기 튜브를 동물의 항문 바로 아래에 대세요. 튜브가 마우스와 직접 접촉하지 않도록 하는 것이 필수적입니다.
      1. 동물이 배설할 때 배설물을 관 안에 모으세요. 모든 대변 샘플이 채취될 때까지 튜브를 실온에 보관하세요. 쥐가 배설하는 데 몇 분이 걸릴 수 있어 배설물을 수거하기 위해 반복적으로 시도해야 합니다.
    3. 대변이 담긴 튜브를 분석 저울로 재세요. 튜브 무게를 소수점 4자리(예: 1.0021 g)로 반올림하여 기록합니다. 얻은 무게를 "최종 튜브 무게"라고 표기합니다.
    4. 대변 샘플을 대변 채취 직후 혐기성 챔버에 넣어 박테리아 수를 조사하세요.
  2. C. difficile 박테리아 집거
    1. C . difficile에 대해 집계될 내용물(대변)의 최종 무게를 계산하세요. "최종 튜브 무게"를 "튜브 무게"에서 빼서 이 작업을 수행했습니다.
    2. 내용물을 1:10 희석하여 1X 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 계산한 후 그에 맞게 재현탁합니다. 대변 펠릿의 경우, 피펫 끝을 사용해 펠릿을 부드럽게 용액으로 섞어 만듭니다.
    3. 이 재현탁된 샘플들을 실온에서 30분간 무산소 배양하여 내용물이 가라앉도록 합니다.
    4. 각 샘플을 1x PBS로 연속 희석하여 분변(대변) g당 집락형성 단위(CFU)를 열거합니다. 이걸 무산소로 하세요.
    5. 무균 기법을 사용하여, 각 연속 희석액 100 μl을 타우로콜레이트 사이클로세린 세폭시틴 과당 한천(TCCFA) 플레이트에 전달합니다. 멸균된 L자형 스프레더를 사용해 배지에 바른 희석액을 판에 고르게 펴 바릅니다. 희석 확산도 군집 정확히 집계하는 데 필수적입니다.
    6. 판을 37°C에서 24시간 무산소 배양하세요. 이 시점에서 C. difficile 군락을 열거하여 분변 내용물당 CFU를 구합니다. C. difficile 군집은 평평하고 연한 노란색이며 가장자리가 불규칙하고 그라운드글라스 같은 모습을 보입니다.
      참고: 이 프로토콜은 회장 및 대장 내 다른 쥐 위장관(GI) 성분과 C . difficile 을 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 중합효소 연쇄반응(PCR) 플레이트는 연쇄 희석을 만드는 데 사용할 수 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1배 PBS깁코10010-023 
박토 아가르벡턴 디킨슨214010TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
박토 프로테오스 펩톤벡턴 디킨슨211684TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
세폭시틴시그마C47856TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
2ml 마이크로 원심분리기 스크류 캡코닝430917 
D-사이클로세린시그마C6880TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
과당피셔L95500TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
인산칼륨 이수소피셔P285-500TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
황산마그네슘(무수)시그마M2643TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
밀렉스-GS 0.22 μm 필터밀렉스-GSSLGS033SSTCCFA 플레이트용 필터
인산수소나트륨시그마S-0876TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
나클피셔S640-3TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
PCR 플레이트피셔브랜드14230244 
플라스틱 페트리 접시코드-발마크 브랜드2900 
멸균 플라스틱 L자형 세포 확장기피셔브랜드14-665-230 
타우로콜레이트시그마T4009TCCFA 번호판의 일부(아래 참조)
초순수 증류수인비트로젠10977-015 
C57BL/6J 마우스잭슨 연구소664쥐는 5주에서 8주 정도여야 합니다

재인쇄 및 허가

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태그

TCCFA

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