대식세포 수용체와 박테리아 항원의 상호작용을 조사하기 위한 형광 기반 분석

초록

출처: 바베로, A. M., et.al. 결 핵균 과 면역 수용체 SLAMF1의 상호작용 연구를 위한 형광 분석법. J. Vis. 경험 ( ( (2025)

이 영상은 대식세포 수용체와 결핵균 항원 간의 상호작용을 연구하기 위한 형광 기반 분석 방식을 시연합니다. 커버슬립에 있는 형광 표지된 항원은 대식세포 단백질 추출물과 함께 배양하고, 가교 결합, 항체 표지로 하며, 겹치는 형광 신호로 시각화됩니다.

프로토콜

1. 형광 현미경에 의한 결핵균-SLAMF1 상호작용

1. 박테리아-단백질 가교 결합
   1. 12mm 원형 커버슬립을 24웰 배양판(웰당 1개)에 둥근 노즈 수술용 핀셋을 사용해 삽입합니다.
      참고: 커버슬립을 70% 에탄올로 꼼꼼히 닦으세요. 원한다면 자외선 아래에서 30분간 오토클레이션이나 멸균할 수 있습니다.
   2. 커버슬립을 4°C에서 10 μg/mL 폴리-D-라이신 400 μL에 하룻밤 배양하세요. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하세요.
   3. 다음 날, 냉장고에서 접시를 꺼내고 커버슬립을 1mL 물로 두 번 씻어주세요.
   4. 커버가 말리게 하세요.
   5. Mtb-R Ags 20 μL (2 x 10⁶)을 180 μL 1x PBS에 희석합니다. 마지막 200μL는 커버슬립을 완전히 덮기에 충분합니다.
   6. 커버슬립을 Mtb-R Ags와 함께 37°C에서 세포 인큐베이터에서 1시간 배양하세요.
   7. 남은 액체는 버리고 1mL 1x PBS(인산 완충 식염수)로 두 번 세척합니다.
      참고: 이 단계에서 Mtb-R이 커버슬립에 올바르게 부착되어 적색 채널에 대응하는 필터를 사용해 형광 현미경으로 확인할 수 있습니다.
   8. 차단 버퍼 400 μL(10% 태아 소 혈청(FBS))을 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 30분간 RT(교반 조절기)에서 추가합니다.
   9. 블로킹 버퍼 400 μL로 두 번 세척합니다.
   10. 단백질 추출물 100 μL을 1x PBS 300 μL에 희석한 상태로 2시간 동안 RT 교반(셰이커)에서 배양합니다.
   11. 1% 포름알데히드 400 μL을 1x PBS에 희석하여 추가합니다. RT에서 15분간 교반(셰이커)으로 배양하세요.
   12. 500 μL 글리신을 0.125 M를 물에 희석하여 추가합니다. RT에서 5분간 교반(셰이커)으로 배양하세요.
   13. 1mL 1x PBS로 두 번 세척하세요.
   14. 2 mM 에틸렌 글리콜 비스(석시니미딜석시네이트) 400 μL (EGS)를 RT 1시간 동안 교반(셰이커)으로 첨가합니다.
   15. 1.1.13 단계를 반복합니다
       참고: 사용 시 시약을 준비하는 것이 강력히 권장됩니다.
2. SLAMF1 염색
   1. 배양 플레이트 뚜껑을 파라핀 필름으로 감싸세요.
   2. 파라핀 필름으로 덮인 뚜껑에 이전에 조절한 항-SLAMF1 1차 항체 60 μL (1:75 희석)를 떨어뜨립니다.
   3. 곡선 모양의 가늘한 수술용 핀셋과 바늘로 커버슬립을 조심스럽게 플레이트에서 떼어내세요.
      참고: 커버슬립 제거를 용이하게 하기 위해 바늘을 약 45° 각도로 구부릴 수 있습니다.
   4. 커버슬립을 항체가 포함된 방울 위에 뒤집어 놓습니다. 어두운 곳에서 RT에서 30분간 부화하세요.
   5. 커버슬립을 들어 올려 블로킹 버퍼로 두 번 세척하세요.
   6. 커버슬립을 2차 항체가 포함된 새로운 방울 위에 뒤집어 1:200 희석합니다. 어두운 곳에서 RT에서 30분간 부화하세요.
   7. 1.2.5단계를 반복합니다.
   8. 남은 액체를 제거하고, 커버슬립을 유리 슬라이드에 놓은 마운팅 액체 한 방울에 부착하세요.
   9. 적절한 필터를 사용해 형광현미경 아래에서 관찰하세요.
      참고: 멸균된 환경에서 작업하는 것이 권장됩니다. 차단 버퍼 안에서 항체를 희석하세요. 현미경 관찰에 방해가 될 수 있는 긁힘이 생기지 않도록 커버슬립을 조심히 다루세요. 형광에 적합한 마운팅 유체를 강력히 권장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알렉사 플루오 488 2차 항체	인비트로젠	A21121	형광 현미경을 위한
항-SLAMF1 1차 항체	바이오레전드	306302	형광 현미경을 위한
아쿠아폴리/마운트	폴리이언스	18606-20	매체 장착
커버슬립 12mm	HDA	-	현미경에 의한 상호작용 분석의 경우
에이지	서모피셔 사이언티픽	21565	가교 처리
포름알데히드	머크	K47740803613	가교 처리
유리 슬라이드	글래스 클래스	-	현미경에 의한 상호작용 분석의 경우
글리신	시그마	G8898	가교 처리
이미저.A2	칼 자이스	430005-9901-000	Colibri 7 조명 모듈이 장착된 형광 현미경
폴리-D-라이신	시그마 올드리치	A-003-M	커버슬립 처리를 위해
로다민 B	시그마 올드리치	21955	M을 위해서. 결핵 염색