마이크로가비지를 이용한 제브라피시 유충 감염 모델 개발

초록

출처: Li, J. 외. 클로스트리디오이데스 디피실에 대한 유충 얼룩말고기 감염 모델 개발. J. Vis. Exp. (2020).

이 영상은 마취된 제브라피시 유충을 아가로스에 고정시키고 추적자 유도 바늘을 이용해 병원성 박테리아를 경구 주입하는 마이크로가비지 시술을 시연합니다. 비침습적 전달은 자연 감염을 모방하여 박테리아 복제, 독소 방출, 장 상피 손상 분석을 가능하게 합니다.

프로토콜

1. 제브라피시 유충의 개버지

1. 마이크로가비지 바늘을 보정하세요.
2. 바늘 끝의 직경을 측정하여 보정 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 넣어 측정합니다. 팁이 지름 30–40 μm이고, 무딘하며, 매끄러워야 합니다. 날카롭거나 거친 바늘은 버리세요.
   참고: 바늘의 날카로운 모서리는 빠른 불꽃으로 무뎌질 수 있습니다.
3. 가비지 용액을 준비하세요.
4. 바늘을 마이크로매니퓰레이터에 장착하고 장전하세요.
5. 마이크로매니퓰레이터를 바늘을 45° 각도로 조정하세요.
6. 제브라피시 유충을 마취하세요. 유충이 멈추면 파스퇴르 피펫을 사용해 마이크로가비지 몰드의 홈으로 옮깁니다.
7. 0.8% 저녹은 아가로스 성분을 제브라피시 유충 위에 떨어뜨려 덮으세요. 유충을 홈 안에서 45° 각도로 똑바로 향하게 하고 꼬리를 홈 벽에 대고 부드럽게 조정하세요. 머리 각도가 대략 같아서 가비지 바늘의 각도와 일치하도록 하세요. 마이크로가비지 몰드를 얼음 위에 30–60초간 두어 저빙 아가로오스가 굳어지도록 하여 유충의 위치를 안정시킵니다.
8. 주입 압력을 200–300 hPa 사이로 조절하세요. 주입 시간을 0.1–0.3초로 설정하여 3–5 nL의 클로스트리디오이데스 디피실 주입 부피를 얻습니다.
9. 바늘을 진탕 부위를 통과한 뒤, 제브라피시 유충의 입 안으로 부드럽게 삽입하여 식도를 통과합니다. 바늘 끝이 전방 장 구구 안에 들어가면 주사 페달을 눌러 박테리아를 배출하세요. 장의 내강을 전달된 양으로 채웁니다. 식도나 항로에서 넘치지 않도록 하세요. 바늘을 제브라피시 입에서 부드럽게 빼세요.
10. 개비지 후에는 유연한 마이크로로더 팁으로 아가로스에서 감염된 제브라피시 유충을 구출합니다. 먼저 아가로스를 잘라낸 후 유충을 들어 올립니다. 이 유충들을 멸균된 30% 다니오 배지로 옮기세요. 유충을 멸균 배지에 두 번 씻어내세요. 유충을 신선한 10cm 페트리 접시로 옮깁니다. 유충은 수정 후 최대 11일간 유지됩니다(dpf).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	시그마-올드리치	A2576	초저 겔링 아가로스
아가로스 저융점(LM)	프로나디사	8050	아가로스 플레이트에 사용됩니다
모세관 유리	하버드 장치	30-0019	주입 바늘
클로스트리디오이데스 디피실			R20291, 리보타입 027 균주, TcdA+/TcdB+/CDT+ 생산
DMSO	칼 로스 GmbH	A994
피지	오픈 소스 플랫폼		이미지 처리
젠장	칼 로스 GmbH	6763
수평 니들 풀러	서터 악기 주식회사	P-87
L-시스테인	시그마-올드리치	168149
라이카 애플리케이션 스위트 X (LAS X)	라이카		이미지 처리
마이크로 인젝터	에펜도르프	5253000017
마이크로사출 몰드	적응형 과학 도구	TU1
라이카 SP8 공초점 현미경	라이카
페놀 레드	시그마-올드리치	P0290
염화칼륨(KCl)	칼 로스 GmbH	5346
염화나트륨(NaCl)	칼 로스 GmbH	9265
타우로콜레이트	칼 로스 GmbH	8149
트리케인	시그마-올드리치	E10521
효모 추출물	BD 박토	212750