진공 침투를 통한 애 기장대 잎에 박테리아 병원체를 접종하기

초록

출처: 루피안, J. S., et.al. 식물 조직 내 슈도모나스 시링기 유전자 발현의 단세포 분석. J. Vis. 경험 (2022)

이 영상은 아라비도시스 식물 잎에 박테리아 병원체를 주입하는 진공 침투 방법을 시연합니다. 이 방법은 준비된 박테리아 현탁액과 진공 펄스를 사용하여 기공을 균일하게 통과시켜 잎 감염을 통제합니다.

프로토콜

1. 애기장대 접종

참고: 이 연구에서 Pseudomonas syringae pv. 균주는 토마토 DC3000과 P. syringae pv. phaseolicola 1448A가 사용되었습니다.

1. P. 시링게 접종을 준비하세요.
   1. 관심 있는 P. 시링에(P. syringae ) 균주를 −80 °C 글리세롤 스톡에서 LB 플레이트(10 g/L 트립톤, 5 g/L NaCl, 5 g/L 효모 추출물, 16 g/L 세균용 한천)에 적절히 항생제를 첨가하여 줄로 뽑아냅니다. 28°C에서 40-48시간 배양하세요.
      참고: 관심 균주가 플라스미드나 유전체 내성 유전자를 보유한 경우 항생제 사용이 권장됩니다. P. 시링에 에 권장되는 항생제 농도는 다음과 같습니다: 카나마이신(15 μg/mL), 겐타마이신(10 μg/mL), 암피실린(300 μg/mL).
   2. 박테리아 생체량을 긁어내고 10 mM MgCl₂ 5mL에 재현탁합니다. OD₆₀₀ 을 측정하고 10 mM MgCl₂를 추가해 0.1로 조정하세요.
      참고: P. 시링기 배양 0.1의 OD₆₀₀은 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹에 해당합니다.
   3. 10 mM MgCl₂ 로 연속 희석하여 최종 접종 농도인 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹에 도달합니다. 애기장대(Arabidopsis) 식물에 200mL의 접종제를 준비하세요.
   4. 접종 직전에 계면활성제 실웨트 L-77을 추가하여 애기장대에 대해 최종 농도인 0.01%로 만듭니다. 참고로 실웻은 애기장대 조직에 다소 해롭습니다.
2. 진공 침투를 수행하세요.
   1. 애기장대(Arabidopsis) 침투 시에는 두 개의 나무 막대를 화분 위에 X자 모양으로 놓고(그림 1E), 화분을 아래를 향해 200 mL 접종구가 들어 있는 지름 14cm 페트리 접시(그림 1F)를 놓습니다.
   2. 접종 용액에 담근 식물을 진공 챔버(그림 1G)에 넣고 500 mbar 펄스를 30초간 가해 잎에 침투시킵니다. 잎이 완전히 침투될 때까지 진공 펄스를 2-3번 반복합니다(그림 1H).
   3. 과잉 접종액을 종이로 배수한 후 식물을 해당 성장실로 돌려놓으세요.

결과

그림 1: 애기장대(Arabidopsis 식물)를 이용한 박테리아 접종 및 아포플라스트 추출. (A) 금속 망이 제대로 부착된 상태로 냄비를 준비하는 것. (B) 씨앗을 이쑤시개로 뿌리는 방식(C)에 따라 분배. (D) 접종 준비가 된 애기장대. (E...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
140 mm 페트리 접시			특별한 요구 사항 없음
세균학적 한천	로코
겐타마이신 황산염	두체파	G-0124
카나마이신 모노황산염	식물기술	K378
MgCl₂	메르크
나클	메르크
실웨트 L-77	크롬턴 유럽 주식회사
트립톤	메르크
진공 챔버 직경 25cm	카르텔	554
진공 펌프	가스	DOA-P504-BN
효모 추출물	메르크
암피실린 나트륨	골드바이오