숙주 상피 세포에서 세포내 브루셀라 아포터스 감염의 고처리량 영상

초록

출처: Casanova, A. 외. 헬라 세포의 브루셀라 감염에 관여하는 숙주 인자의 고처리량 스크리닝을 위한 현미경 기반 분석법. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 상피세포에서 브루셀라 아포터스 감염을 siRNA 매개 STING 넉다운으로 고처리량으로 영상화하여 세포 내 박테리아 복제와 숙주 선천 면역 반응에서 세포질 DNA 감지의 역할을 조사합니다.

프로토콜

1. 감염과 고정

1. 감염 하루 전, 50ml TSB/Km(50 μg/ml 카나마이신 함유 트립틱 대두 육수) 배양지에 일정량의 B. abortus 스타터 배양물을 250ml 스크류 캡 병에 접종합니다. 병을 파라필름으로 밀봉하고, 37°C, 100rpm에서 오비탈 셰이커에서 OD₆₀₀ = 0.8-1.1까지 박테리아를 밤새 배양합니다.
2. 박테리아 배양액의 OD₆₀₀ 을 측정하고, 감염 배지를 DMEM(둘벡코 변형 독수리 배지)/10% FCS(태아 송아지 혈청)에 희석하여 원하는 감염 다중성(MOI)을 달성합니다.
   참고: HeLa 세포에서 5-10%의 감염률을 얻기 위해서는 10,000의 MOI가 사용됩니다. 최적의 감염률을 얻기 위해 각 세포 유형별로 MOI 적정 곡선을 수행해야 합니다.
3. 자동 플레이트 와셔를 사용해 384웰 플레이트의 형질교환 배지를 감염 배지 50μl과 교환합니다.
4. 384웰 플레이트를 400 x g, 4 °C에서 20분간 원심분리합니다.
   참고: 이것은 감염 과정을 동기화하는 데 도움이 됩니다.
5. 플레이트를 파라필름으로 밀봉한 후, 미리 데워진 알루미늄 플레이트 위에 5%_CO....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립틱 두유 육수 (TSB)	플루카	22092
카나마이신 황산염	시그마-올드리치	60615
250ml 스크류 캡 병	코닝	8396
DMEM	시그마-올드리치	D5796
태아 송아지 혈청(FCS)	깁코	10270	열 비활성화
그라이너 셀스타 384웰 플레이트	시그마-올드리치	M2062
벗길 수 있는 알루미늄 호일	코스타	6570
시약 디스펜서: "멀티드롭 384 시약 디스펜서"	써모 사이언티픽	5840150	대체 시약 디스펜서를 사용할 수 있습니다.
형질전환 시약: "리포펙타민 RNAiMAX"	인비트로젠	13778-150
자동 플레이트 와셔: "플레이트 와셔 ELx50-16"	바이오텍	ELX5016	이 플레이트 와셔는 384웰 플레이트에 적합한 16채널 매니폴드를 포함하고 있습니다. 이 장치는 바이오세이프티 캐비닛에 들어가며, 세척 시 플레이트를 덮는 뚜껑이 있어 에어로졸 생성 위험을 줄여줍니다. 유사한 기능을 가진 대체 플레이트 와셔도 사용할 수 있습니다.
젠타미신	시그마-올드리치	G1397
PBS	깁코	20012
파라포름알데히드	시그마-올드리치	P6148	0.2 M HEPES 버퍼에 녹여, pH 7.4. -20°C에서 보관하고 사용 하루 전에 신선하게 해동하세요. 주의하세요, PFA는 흡입, 피부 접촉, 삼키는 경우 독성이 있습니다.
젠장	시그마-올드리치	H3375
트리톤 X-100	시그마-올드리치	T9284
다피	로슈	10236276001
Kif11 siRNA	다르마콘	L-003317-00
ARPC3 siRNA	다르마콘	L-005284-00
브루셀라 아보르투스 2308
헬라 CCL-2	ATCC	CCL-2
이미지프레스 마이크로	분자 장치	IXM 이미징 MCSCOPE	정밀 모터 구동 Z-스테이지가 장착된 자동 세포 영상 현미경. 아래에 명시된 자동 현미경 및 하드웨어 및 소프트웨어용 대체 부품을 사용할 수 있습니다.