자극 라만 산란 현미경을 이용한 박테리아 항생제 감수성 검출

초록

출처: Zhang, M. 외, 단일 박테리아 내 중수소 통합 자극 라만 산란 영상을 통한 신속 항균 감수성 검사. J. Vis. Exp. (2022)

이 영상은 자극 라만 산란 현미경을 활용해 중수소 표지된 대사 활동을 추적하여 항생제에 대한 감수성을 평가하는 방법을 시연합니다. 탄소-중수소 신호를 모니터링함으로써 내성 및 감수성 박테리아 집단을 신속히 검출할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. D₂항생제 사용 시 O 통합 치료 (그림 1a)

1. 광도계로 600 nm 파장의 광학 밀도(OD)를 측정하여 박테리아 농도를 확인하세요.
2. 박테리아 용액을 중수소가 없는 일반 Mueller-Hinton 육수(MHB) 배지를 사용해 최종 세포 농도인 8 x 10⁵ CFU/mL에 도달합니다. 부드럽게 소용돌이를 만들어 박테리아 세포를 섞으세요.
3. 1.5mL 마이크로튜브 7개에 박테리아 용액 300 μL 알리코트를, 1.5 mL 마이크로 튜브 1개에 600 μL 박테리아 용액을 준비합니다.
4. 600 μL 박테리아 용액이 들어 있는 마이크로 튜브에 항생제(겐타미신 또는 아목시실린 1 mg/mL) 4.8 μL 스톡 용액을 첨가하여 최종 항생제 농도를 8 μg/mL로 만듭니다.
5. 8 μg/mL의 항생제 함유 박테리아 용액에서 300 μL 용액을 추출하고, 또 다른 300 μL 박테리아 용액에 더해 두 배로 희석된 항생제(4 μg/mL) 박테리아 용액을 만듭니다.
6. 시험 항생제, 겐타미신, 아목시실린을 두 번 연속 희석하여 가장 낮은 마이크로 튜브(0.25 μg/mL)에 도달할 때까지 반복하고, 튜브에서 300 μL을 버립니다. 겐타미신과 아목시실린 모두 일련의 농도는 0.25 μg/mL에서 8 μg/mL 사이입니다.
   1. 항생제 없이 한 튜브를 남겨두어 블랭크 컨트롤을 하세요. 이 검사는 항생제 치료 없이 D₂O 처리를 통해 박테리아 대사 활동을 검사하는 양성 대조군이 될 것입니다.
   2. 음성 대조군은 항생제와 D₂O를 제외한 한 튜브를 남겨두세요.
7. 박테리아 알리코트를 특정 항생제(겐타미신 또는 아목시실린)와 MHB 배지를 1시간 배양하세요.
8. 인큐베이션 중에는 1.6단계에서 조제한 항생제와 동일한 농도 구배를 가진 100% D₂O 함유 배지로 항생제를 연속적으로 희석합니다. 겐타미신과 아목시실린 모두 일련의 농도는 0.25 μg/mL에서 8 μg/mL 사이입니다.
9. 항생제 치료 1시간 후, 1.6단계에서 준비된 동일한 항생제 농도의 300 μL 항생제 전처리 박테리아에 각각 700 μL 연속 희석 항생제와 100% D₂O 함유 MHB 배지를 첨가합니다.
   1. 예를 들어, 8 μg/mL 항생제 포함 300 μL 8 μg/mL 항생제 전처리 박테리아에 100_{% D 2}O 함유 MHB 배지 700 μL를 첨가합니다. 같은 방식으로 다음 농도의 해당 튜브로 옮기고, 피펫을 여러 번 위아래로 움직이며 균질화합니다.
   2. 항생제 무첨가 100% D₂O-함유 MHB 배지 700 μL을 항생제 없는 박테리아 300 μL(1.6.1단계에서 준비)를 빈 대조군으로 추가합니다.
   3. 37°C에서 200rpm의 인큐베이션 셰이커에서 추가로 30분간 배양합니다.
      참고: 이 단계에서 시험용 배지 내 최종 D₂O 농도는 70%입니다.
10. 먼저 항생제 1mL와 D₂O를 4 °C에서 6200 x g 에서 5분간 원심분리한 후 정제수로 두 번 세척합니다. 마지막으로 샘플을 10% 포르말린 용액에 고정하여 4 °C에서 보관합니다.

2. 단일 박테리아 내 D₂O 대사 통합 자극 라만 산란(SRS) 영상

1. 정제된 물로 고정된 박테리아 용액 1mL를 세척한 후, 6200 x g 온도에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상원액을 제거합니다. 박테리아 용액을 약 20 μL로 농축합니다.
2. 박테리아 용액을 폴리-L-라이신 코팅 커버글라스 위에 침투하세요. 샘플을 샌드위치로 밀봉하여 SRS 영상 촬영을 하세요.
3. SRS 현미경을 사용해 2168 cm-1의 C-D 진동 주파수에서 박테리아를 촬영합니다.
   1. 컴퓨터의 제어 소프트웨어를 사용해 펌프 파장을 852nm로 입력하고 조정하세요.
   2. 파워미터를 사용해 레이저 출력을 측정하세요. 샘플에서 펌프 레이저의 출력을 ~8 mW, 스톡스 레이저 출력을 ~40 mW로 설정하여 레이저 출력 앞의 반파장 판을 조정합니다.
      참고: SRS 현미경에서는 80MHz 반복 속도를 가진 가변 가능한 펨토초 레이저가 펌프(680에서 1300 nm)와 Stokes(1045 nm) 여기 레이저를 제공합니다.
4. 반사 거울의 나사를 조정하여 펌프 빔과 스톡스 빔을 공간적으로 정렬하고, 두 빔을 레이저 스캔용 2D 갈보 미러 시스템이 장착된 직립 현미경으로 유도합니다.
   1. 60배 물에 담긴 대물렌즈를 사용해 펌프와 스톡스 레이저를 샘플에 집중하세요.
   2. 오일 콘덴서를 사용해 시료에서 전방 방향으로 신호를 수집하세요.
   3. 밴드패스 필터를 사용해 스톡스 레이저를 필터링한 후 포토다이오드로 유도하세요.
   4. 락인 증폭기로 자극된 라만 신호를 추출하고, 포토다이오드로 신호를 검출합니다.
5. 각 SRS 이미지는 소프트웨어 제어판에서 200 x 200 픽셀과 30 μs 픽셀 체류 시간을 설정하세요. 한 장의 전체 획득 시간은 ~1.2초입니다. 스텝 크기를 150 nm로 설정하여 이미지 크기를 약 30 x 30 μm²로 만듭니다. 각 샘플마다 최소 세 개의 시야각을 촬영하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
음향-광학 변조	구치&하우스고	R15180-1.06-LTD	레이저 빔을 변조하는 스토크
아목시실린	시그마 올드리치	A8523-5G
대역통과 필터	크로마	HQ825/150m	포토다이오드 전에 스톡스 레이저 빔을 차단하세요
염화칼슘	시그마 올드리치	C1016-100G	양이온 조정
양이온 조정 뮬러-힌턴 육수	피셔 사이언티브	B12322	육수 희석법을 이용한 미생물의 항균 감수성 검사
원심분리기	써모 사이언티픽	75002542
덮개 유리	VWR	16004-318
스냅캡이 있는 배양관	피셔 브랜드	149569B
중수소 산화물		151882	항생제를 용해하는 유기 용매
산화수소-d6	시그마 올드리치	156914	SRS 영상 시스템 교정을 위한 표준으로서의 유기 용매
대장균 BW 25113	대장유전 자원 센터	7636
에펜도르프 폴리프로필렌 마이크로 원심분리관 1.5 mL	피셔 브랜드	05-408-129
겐타미신 설페이트	시그마 올드리치	G4918
친수성 폴리비닐리덴 플루오라이드 필터	밀리포어-시그마	SLSV025NB	기공 크기 5 μm
인사이트 딥씨 펨토초 펄스 레이저	스펙트럼-물리학	모델: 인사이트 X3	SRS 이미징을 위한 1045 nm 주파수의 조정 가능한 레이저 광원 및 고정 레이저 광원
락인 앰프	취리히 악기	HF2LI	SRS 신호를 복조합니다
오일 콘덴서	올림포스	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa(슈도모나스 아에루기노사) ATCC 47085 (PAO1)	미국 타체 문화 컬렉션	ATCC 47085
포토다이오드	하마마츠	S3994-01	검출기
폴리프로필렌 원뿔관 15 mL	팔콘	14-959-53A
폴리프로필렌 필터	써모 사이언티픽	726-2520	공극 크기 0.2 μm
멸균 페트리 접시	코닝	07-202-031
주사기 10 mL	피셔 브랜드	14955459
UV/VIS 분광광도계	벡먼 쿨터	모델: DU 530	600 nm 파장에서의 광학 밀도 측정
보텍스 믹서	VWR	97043-562
수자원 목표물	올림포스	우플라나포/IR	60×, NA 1.2