초파리 유충에서 세균 감염 확립

초록

출처: Hiroyasu, A., D 외, 미생물 감염을 위한 초파리 흑가스터 유충에서 혈구 추출 및 분석. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 초파리 유충을 박테리아 방울에 넣고 텅스텐 바늘로 찌르는 과정을 시연합니다. 유충은 홈이 있는 영양분이 풍부한 한천 플레이트 위에서 배양되어 숙주-병원체 상호작용을 연구합니다.

프로토콜

1. 생체 내 감염

1. 초파리 과일 주스 한천 플레이트를 실온에서 15분간 데우세요.
   1. 한천 30g을 700mL 물에 넣고 40분간 오토클레이브합니다.
   2. 메틸 파라벤 0.5g을 10mL의 절대 에탄올에 녹입니다.
   3. 메틸 파라벤 용액을 과일 주스 농축액 300mL에 넣으세요.
   4. 액즙 농축액을 오토클레이드 한천 용액에 빠르게 섞어 5mL를 10× 35mm 페트리 접시에 분배합니다.
   5. 판이 15분간 식은 후 4°C에서 보관하세요.
2. 3령 유충을 준비하세요.
3. 효모 페이스트를 한천 플레이트에 올려놓습니다. 유충이 이동할 수 있는 한천판에 미세한 절단을 하여 건조를 방지합니다(그림 1A). 파라핀 필름을 사용해 고정 겸자와 함께 0.001mm 뾰족한 텅스텐 바늘을 조립합니다(그림 1B, C).
4. 고역가 m체리 발현-Coxiella burnetii ×50 μL 피펫을 입체 현미경 아래 파라핀 필름에 적시한 후 유충을 박테리아 웅덩이에 넣습니다.
5. 유충을 박테리아 웅덩이에 넣고, 텅스텐 바늘로 찔러 넣은 뒤(그림 3D), 한천 판(그림 1E)으로 옮깁니다.
6. 남은 병원체 배지를 한천 배지에 옮기고 낙엽 막으로 밀봉합니다.
7. 감염 후 원하는 시간까지 유충을 습한 공기 중에 보관하세요(그림 1F). 이 실험에서는 C. burnetii에 감염된 유충을 24시간 동안 배지에 올려놓습니다.

결과

그림 1: 생체 내 감염. A) 초파리 과일 주스, 한천 플레이트, 효모 페이스트가 생체 감염 유충의 배양에 사용됩니다. 유충의 수명을 돕기 위해 한천 판에 절단(회색 화살표)이 있습니다. B) 0.001mm 뾰족한 텅스텐 바늘을 파라핀 필름으로 겸자에 부착합니다. C) 0.001mm 뾰족한 텅스텐 바늘의 끝. D) 유충을 병원체 풀에 있는 파라핀 필름 내 입체 현미경 아래 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
입체 현미경	암스코프	SM-1BSZ-L6W
겸자	VWR	82027-402
콕시엘라 버네티이 - m체리	하인젠 박사, R.
초파리 과일 주스 접시	콜드 스프링 항구 프로토콜		http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
아가르	피셔 바이오리에이전트	BP1423-500
메틸 파라벤	암레스코	0572-500G
절대 에탄올	피셔 바이오리에이전트	BP2818-500
웰치스 100% 포도 주스 냉동 농축액, 340 mL	아마존	B0025UJVGM
페트리 접시, 10 x 35mm	피셔 사이언티브	08-757-100A
효모, 베이커스 건조 활성	MP 생의학	210140001	효모 1에 물 2부를 넣으세요 (v/v)
텅스텐 바늘	파인 사이언스 툴즈	10130-20
겸자 잡기	VWR	HS8313
리스테리아 모노사이토제네스	ATCC	변형: 10403S	리스테리아 모노사이토제네스 균주 10403S(Bishop and Hinrichs, 1987)는 30°C에서 50 μg/ml 스트렙토마이신을 함유한 Difco 뇌심장 주입(BHI) 육수(BD Biosciences)에서 배양되었습니다.