식물 추출 병원체에서 유전자 발현의 단세포 분석

초록

출처: 루피안, J. S. 외 식물 조직 내 슈도모나스 시링기 유전자 발현의 단세포 분석. J. Vis. 경험 (2022).

이 영상은 형광 표지 전사 인자를 사용하여 식물 추출 병원성 박테리아의 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 분석하는 방법을 시연합니다. 공초점 영상은 병원성 유전자 발현의 이질성을 드러내어 클론 박테리아 집단 내의 기능적 다양성을 강조합니다.

프로토콜

1. 세포 세포 세포 추출 박테리아의 분석

1. 증류수에 1.5% 아가로스 용액을 준비하세요. 녹은 후에는 나란히 놓은 두 개의 현미경 슬라이드 사이 공간을 채울 만큼 충분한 부피를 추가하고, 그 위에 또 다른 슬라이드를 올립니다(그림 1). 15분간 말린 후 위에 올려진 슬라이드를 조심스럽게 제거하세요. 사용 직전에 칼날로 아가로스 패드를 5mm x 5mm 크기로 잘라내세요.
2. 동시에, 상온에서 12,000 x g의 원심분리기 12,000 x g 에서 1분간 원심분리한 후, 피펫으로 조심스럽게 상원액을 제거한 후 펠릿을 20 μL의 물에 재현탁하여 세포를 농축합니다. 농축된 세포 2 μL 방울을 0.17 mm 커버슬립 위에 놓고, 1단계에서 얻은 5 mm x 5 mm 크기의 아가로스 패드 조각으로 덮으세요( 그림 1에 나타난 것).
3. 공초점 현미경으로 박테리아 준비 과정을 시각화하세요( 재료표 참조). 녹색형광 박테리아를 식별하려면 488nm 여기 레이저와 500 nm에서 550 nm 범위의 방출 필터를 사용한다. 모든 박테리아를 식별하려면 밝은 영역을 사용하고 두 영역을 합치세요.
4. 공초점 이미지를 피지( 재료표 참조)를 사용해 처리하세요. 이를 위해 MicrobeJ 플러그인을 사용해 박테리아 세포의 윤곽을 식별하고 내부 형광 강도를 측정하세요.
   참고: 이 분석에는 군집이 아닌 분리된 박테리아에서 이미지를 획득하는 것이 권장됩니다.

결과

그림 1: 한천 패드의 설정 및 준비 도식.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.17 mm 커버슬립			특별한 요구 사항 없음
1.6 x 1.6mm 금속 메시	부즈푸		유리섬유 스크린 메시
50 mL 원뿔관	사르스테트
아가로스	메르크
공초점 현미경 Stellaris	라이카 마이크로시스템즈
피지 소프트웨어