1. 균주 및 배양 조건
참고: 합성 구강 군집은 구강 미생물군에 흔히 존재하는 균주로 구성되었습니다.
- 미국 유형 배양 컬렉션(ATCC)에서 다음 균주를 얻으세요: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), 스트렙토코커스 고르도니이 (ATCC 49818), 액티노마이세스 비스코스수스 (ATCC 15987), 스트렙토코커스 미티스 (ATCC 49456)입니다.
- 라이프니츠 연구소 DSMZ-독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(DSM 2007)에서 Veillonella parvula 를, BCCM/LMG 박테리아 컬렉션(LMG 14657)에서 Streptococcus sanguinis 를 획득하고, Streptococcus salivarius 균주 TOVE-R과 Streptococcus oralis를 사용하세요.
2. 구강 미생물군을 대표하는 다종 군집 개발
참고: 구강 박테리아가 시험관 내 장 상피에 부착할 수 있는 잠재력을 시뮬레이션하기 위해 합성 군집을 생성하세요. 혈액 한천 플레이트에 5 μg/mL 헤민, 1 μg/mL 메나디온, 5% 멸균 제세혈 말 혈액을 보충하여 박테리아를 배양합니다. 간단히 말하면:
- 헤민 100mg을 1M 수산화나트륨(NaOH) 2mL에 녹이고, 증류된 오토클레이브수 100ml를 추가합니다. 어두운 용기에 보관하세요. 매체에 첨가하기 전에 0.22 μm 필터로 멸균하세요.
- 메나디온 100mg을 96% 에탄올 20mL에 녹입니다. 매체에 첨가하기 전에 0.22 μm 필터로 멸균하세요.
- 제조사의 지침과 오토클레이브에 따라 혈액 한천 배지 1L( 재료표 참조)을 준비하세요. 말 피와 보충제를 넣기 전에 식히세요. 접시를 섞고 부어.
- 변형된 뇌심장 주입(BHI) 육수를 준비하세요. 오토클레이빙 후 헤민 5 μg/mL와 메나디온 1 μg/mL를 추가합니다.
- Hungate 튜브에 매체 9mL를 투여하고, 고무 마개와 알루미늄 캡으로 밀봉합니다. 튜브를 질소/이산화탄소 또는N2/CO2 (90%/10%)로 세척하세요.
- 주사기로 혐기성 배지 1mL를 채취하여 1.5mL 마이크로 원심분리관에 넣습니다. 각 박테리아 종의 단일 군락을 채취하여 배지에 재현탁한 후 혐기성 변형 BHI로 다시 옮깁니다. S . salivarius는 24시간 배양해야 하며, 37°C에서 48시간 배양합니다.
- 필요하다면 합성 공동체를 구성하기 전에 배양의 순수성을 확인하세요. 간단히 말하면:
- 액체 배양에서 DNA를 추출하여 프라이머 27F(AGAGTGTGTGATYMTGGCTCAG)와 1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACT)을 사용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하고, 다음 프로그램을 진행합니다: 95°C에서 5분, 95°C에서 1분간 30주기, 1분간 55°C, 1분간 72°C에서 72°C에서 마지막 연장 단계.
- 제조사의 지침에 따라 상업용 키트(재료 표 참조)로 중합효소 연쇄반응(PCR) 제품을 정제하세요.
- 정제 생성물의 시퀀싱 반응을 10 μL 총 부피에서 0.5 μL 염료(재료 표 참조), 3.2 pmol의 M13f 프라이머(CGCCAGGGTTCCCACGAC), 2.0 μL 5배 시퀀싱 버퍼 2.0 μL, 20 ng 주형을 사용하여 상업용 시퀀싱 시스템과 키트를 사용하여 수행합니다(재료 표 참조).
참고: 이 시술은 상업적으로 시행되었습니다. - 모든 서열(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 대해 BLAST 검색을 수행하여 가장 가까운 알려진 분류군을 파악하고, RDP 분류기 온라인 도구(http://rdp.cme.msu.edu/)와 SINA 정렬 서비스(https://www.arb-silva.de/aligner/)를 사용하여 원래 균주의 서열과 비교합니다.
- 유세포 측정과 SYBR 그린/프로피디움 요오드 염색을 사용하여 배양 종료 시 세포 수를 측정합니다. 배양물을 변형 BHI를 사용해 105 세포 mL-1로 희석합니다.
- 1 mL의 S. mitis 를 75mL의 혐기성 BHI에 첨가하여 정지기(6시간)까지 배양합니다. 그 후 희석된 균주별로 0.75mL씩 채취하여 혐기성 조건에서 혼합합니다.
- 모든 배양물이 혼합되면 미시코스모스 1mL를 추출하고 75mL의 BHI에 추가합니다. 합성 군집을 10%CO2, 10% 수소(H2), 80% N 조건에서 37 °C, 200 rpm에서 48시간 배양합니다( 재료표 참조).
- 2.8에서 측정한 세포 밀도를 측정하세요. 커뮤니티를 셀 모델에 소개하기 전에. 군집의 구성은 정량적 실시간 PCR로 평가할 수 있습니다. 또한, 16S rRNA 유전자 증폭자 시퀀싱을 사용하여 초기 구성원에 대한 정보를 제공합니다. 두 신원 확인 프로토콜 중 어느 쪽에서도, 단백질을 적극적으로 전사하는 박테리아를 나타내는 cDNA를 템플릿으로 사용하고, 균주의 존재 여부를 드러내는 데 DNA를 템플릿으로 사용합니다.
3. 일반 세포 배양 실천
참고: 유럽 인증 세포 배양 컬렉션(Caco-2 ECACC 86010202 및 HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, 영국 공중보건부)에서 사용하는 세포주를 획득하세요. 세포 배양용 시약은 별도 명시가 없는 한 구매할 수 있습니다(재료 표 참조).
- Caco-2 및 HT29-MTX 세포주의 유지 및 통과 참고: Caco-2와 HT29-MTX 세포는 보충된 dulbecco's modified eagle medium(DMEM)이 포함된 25cm2 조직 배양 플라스크에서 일상적으로 배양됩니다(표 1). 세포는 60–70% 합류에 도달하면 트립신화됩니다.
- 플라스크에서 세포 배양지를 꺼내세요. 칼슘/마그네슘 없이 5mL PBS(Ca++/Mg++)로 두 번 세척하세요.
- 0.5 mg/L 트립신 용액 2 mL와 0.22 g/L 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)을 첨가합니다. 플라스크를 부드럽게 움직여 트립신 용액을 분배하세요. 트립신 용액 1.5mL를 제거하고 플라스크를 37°C에서 10분간 배양합니다.
- 현미경으로 플라스크 표면에서 세포가 분리되어 있는지 확인해 보세요. 필요하면 추가로 5분간 배양하세요.
- 플라스크에 5mL의 보충 세포 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 피펫을 위아래로 움직여 균질한 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
- 즉시 세포 현탁액 50 μL 알리코트를 취해 멸균 0.4% 트리판 블루 용액과 1:1(v/v) 비율로, HT29-MTX는 1:5 v/v 비율로 혼합합니다. 피펫팅으로 혼합하여 카운팅 챔버에 넣습니다( 재료표 참조).
- 현미경으로 살아남은 세포(백광 세포)를 세세요(제조사 설명서 참조).
- Caco-2와 HT29-MTX의 경우 각각 4 x 105 cells/cm 2 및 1 x 104 cells/cm2 밀도의 새 플라스크에 씨앗을 넣었습니다.
참고: (1) 카코-2 세포는 분화하여 합류점에 도달하면 밀착 접합을 형성합니다. 트립신화 전에 과도한 수합을 피하는 것이 매우 중요합니다. 플라스크 내 세포의 과증식은 트립신화 및/또는 세포 응집 후 세포 박리 실패를 일으킬 수 있습니다. (2) HT29-MTX 세포는 점액을 생성하는 세포로, 대사 활성이 높습니다. 이러한 특성들은 특히 세포 밀도가 높은 경우 세포 배양 배지의 빠른 산성화를 초래할 수 있습니다. 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지네에설폰산(HEPES) 완충제를 세포 배양지에 첨가하여 pH를 7에서 7.2 사이로 유지할 수 있습니다(표 1). pH가 떨어지면 수합도가 50% 미만일 때 매질을 교환할 수 있습니다. 하지만 합류율이 50%>경우, 세포 배양을 분리해야 합니다.
4. 장내 숙주-미생물 인터페이스를 시뮬레이션하는 다중 구획 세포 모델 조립
참고: 이중 챔버 웰(직경 24mm, 공극 크기 0.4 μm; 재료표 참조)에서 공동 배양을 완료하세요.
- 첨단 구획에는 완전 세포 배양 배지 1.5mL를, 기저부에는 2mL를 추가합니다. 씨앗을 뿌릴 때 세포 현탁물이 고르게 분포되도록 20–30분 동안 사전 인큐베이트하세요.
- 3절에 설명된 대로 Caco-2와 HT29-MTX의 세포 배양을 트립신화합니다. 트립신화 절차는 두 세포주가 단일 세포 현탁 상태에서 뭭 없이 균일하게 분포하도록 정확히 따라야 합니다.
- 3.1.8에 설명된 대로 생존 가능한 세포를 세세요.
- 세포 밀도를 6.5 x 104 cells/cm2 로 조정하고, Caco-2/HT29-MTX 세포의 비율이 90/10입니다.
- 세포 현탁액을 균질화한 후, 해당 부피의 Caco-2와 HT29-MTX 세포를 보충된 세포 배양 배지가 포함된 채워진 멸균 용기에 추가합니다. 흡입으로 챔버 꼭대기에서 사전 인큐베이드 배지를 제거합니다.
- 피펫팅으로 세포 현탁액을 부드럽게 혼합한 후, 챔버 삽입물의 꼭대기 구획에 1.5mL를 옮깁니다. 씨앗 뿌리는 과정은 세포가 침전되기 때문에 세포 현탁물을 지속적으로 균질화해야 합니다. 사용자의 경험과 작업 속도에 따라 셀 현탁액은 1–3개의 웰을 분사한 후 혼합해야 합니다.
- 판을 부드럽게 앞뒤로, 그리고 오른쪽에서 왼쪽, 오른쪽으로 5–10번 이동시켜 웰 내 셀의 고르게 퍼지게 합니다. 인큐베이터로 옮기고 플레이트 이동을 반복하세요.
- Caco-2/HT29-MTX 세포의 공동 배양을 15일간 유지하고, 2일마다 꼭대기 및 기저 구획을 DMEM 보완으로 갱신합니다. 이 기간 이후에는 세포 배양지를 항생제/항균류 용액 없이 보충된 DMEM으로 교체할 수 있습니다.
- 매체를 2일마다 교체하여 파종 후 20일에서 21일까지 시스템을 유지하세요.
- 제조사의 지침에 따라 전기 저항 시스템(재료표 참조)을 사용하여 상피 장벽 무결성을 측정하여 분석을 시작하세요.
- 측정을 시작하기 전에 경상피 전기 저항(TEER) 장비가 완전히 충전된 상태(>24시간)를 반드시 확인하세요.
- TEER 장비를 전원 공급장치에서 분리하고 플라스틱 오토클레이브 백으로 덮으세요. 봉지에 구멍을 뚫어 전극을 넣고 미터의 입력 포트에 꽂으세요. TEER 장비를 플로우 캐비닛에 넣기 전에 70% 에탄올/물(v/v)을 뿌리세요.
- 전극을 소독할 때, 전극 끝을 70% 에탄올/물(v/v) 용액에 15분간 담가세요. 15초간 자연 건조하세요. 전극을 미리 가열한 세포 배양 배지에 씻어내세요.
- 세포를 인큐베이터에서 꺼내고 플로우 캐비닛 안에서 세포가 상온에 도달하도록 하세요.
- 미터가 충전기에서 분리되어 있는지 확인하세요. 모드 스위치를 옴으로 설정하고 전원 스위치를 켜세요.
- 전극을 짧은 팁을 인서트에 담가, 긴 팁을 웰 밖으로 담가서 셀 저항을 측정합니다. 전극은 판 인서트와 90° 각도로 유지하세요.
5. 시험관 내 위장관 통과 조건 후의 박테리아 생존
참고: 모든 희석물은 초순수수로 준비하세요. 0.22 μm 필터를 통해 모든 용액을 필터 멸균하고 멸균 조건에서 소화 절차를 수행합니다.
- 구강 소화:
- 박테리아 군집 3mL를 50mL 멸균관에 넣고, 3mL의 모조 타액액(SSF)과 혼합합니다. SSF는 mmol L-1 기준으로: 염화칼륨(KCl), 15.1; 인산칼륨 이수소(KH2PO4), 3.7; 중탄산나트륨(NaHCO3), 6.8; 염화마그네슘 육수화물 [MgCl2(H2O)6], 0.5, 탄산암모늄 [(NH4) CO3], 0.06; 염산(HCl) 1.1; 염화칼슘 이하이드레이트 [CaCl2(H2O)2], 0.75. 인간 타액 IX-A형에서 나온 75 U/mL의 α-아밀라아제와 돼지 위형 II에서 나온 2 g/L 점액을 SSF에 추가합니다.
- 혼합물을 37°C, 100rpm에서 2분간 배양하세요. DNA 추출 및 유세포분석 정량(S1)을 위해 2mL 샘플을 채취합니다.
- 위 소화:
- 4mL의 모의 위액(SGF)을 추가하면, (mmol L-1 기준): KCl, 6.9; KH2포4, 0.9; NaHCO3, 25; 염화나트륨(NaCl) 47.2; MgCl2(H2O)6, 0.1; (NH4)CO3, 0.5; HCl은 15.6; CaCl2(H2O)2, 0.075. 또한 SGF에는 돼지 위장 II형에서 추출한 2g/L 점액이 포함되어 있었습니다.
- 필요하다면 pH를 측정하고 1M HCl과 함께 pH 3으로 조정하세요. 37°C, 100rpm에서 인큐베이팅하세요. 2 mL 샘플(S2)을 채취하세요.
- 소장 소화:
- 4mL의 모의 장액(SIF)을 추가하면(mmol L-1 기준): KCl, 6.8; KH2PO4, 0.8; NaHCO3, 85; NaCl, 38.4; MgCl2(H2O)6, 0.33; HCl은 8.4; CaCl2(H2O)2, 0.3, 소화관에 공급.
- 필요하다면 pH 7에 1M NaOH를 넣어 조절하세요. 37°C, 100rpm에서 인큐베이팅하세요. 2 mL 샘플(S3)을 채취하세요.
6. 시험관 내 위장 통과 조건 이후의 박테리아 정착 능력
- 소장 소화 2mL를 2,650 x g에서 10분간 원심분리합니다.
- 상원액을 제거하고 박테리아 펠릿을 항생제와 항균제를 사용하지 않은 5mL 보충된 DMEM과 혼합하세요.
- 유세포계를 사용해 온전하거나 손상된 세포를 염색하고 정량화하세요(재료 표 참조).
- 항생제와 항균제를 사용하지 않은 보충제 DMEM에 희석하여 세포 밀도를 10 5개의 생존 가능한 세포/mL로 조절합니다.
- 트랜스웰 시스템의 꼭짓 배지를 제거하고 박테리아 현탁액 1.5mL를 추가하세요. 일반 세포 배양 조건(37°C, 습도 95%,CO2 5%) 하에서 2시간 동안 시스템을 공동 배양합니다.
참고: 이 시간은 필요한 실험 프로토콜에 따라 최대 48시간까지 연장될 수 있습니다. 공배양은 오염을 방지하기 위해 일상적인 세포 유지에 사용되는 인큐베이터와는 다른 인큐베이터에서 유지할 수 있습니다. - 4.11에 설명된 대로 인큐베이션 후 TEER 값을 측정하여 상피 장벽의 무결성을 평가합니다.
- 배양 시간이 끝나면 꼭대기 배지를 제거하고 추가 분석을 위해 0.5mL를 채취합니다(S4). 배지의 하위 샘플은 제조사의 지침에 따라 락테이트 디하이드로게나제(LDH) 분석법(재료 표 참조)을 통해 세포 생존 가능성 평가에 사용할 수 있습니다.
- HBSS(NAC 완충제)에 10 mM N-아세틸시스테인 0.5mL를 첨가하여 HT29-MTX에서 생성된 점액을 용해시키고 부착된 박테리아를 회수합니다. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 교반(135rpm, 재료표 참조)으로 인큐베이팅합니다.
- NAC-HBSS를 마이크로 원심분리관(S5)에서 회수한 후 세포를 1 mL DPBS로 두 번 세척합니다.
- 단일층 위에 0.5% Triton X-100(w/v) 0.5mL를 추가하고, 피펫으로 세포를 교란한 뒤 액체를 회수한 후 1분간 소용돌이 돌리세요. 세제로 박테리아 세포를 손상시키지 않도록 속도를 조절하는 것이 중요합니다.
- 세포를 2,650 x g에서 5분간 원심분리한 후 상청액(S6)과 펠릿(S7)을 분리합니다.
7. 표본 분석
참고: 모의 위장 소화 후 장 세포에 대한 박테리아의 생존력과 부착 가능성을 평가하기 위해 수집된 샘플(S1-S7)을 분석합니다.
- 박테리아 생존력: 샘플 S1-S5를 0.45 μm 필터를 두 번 통과시키고, 2.8단계에서 설명한 대로 생세포/죽은 세포 염색 및 유세포분석을 통해 박테리아 세포를 정량합니다.
- 접착 잠재력: S1-S6에 대해 연속 희석(-1에서 -8)을 준비하고, 혈액 한천과 변형된 BHI 플레이트에 10 μL 스트릭을 합니다. 37°C에서 혐기성 조건에서 24–48시간 배양합니다. 희석되지 않은 S7도 같은 부피로 도금하세요.
- 부착된 박테리아의 분류학적 식별:
- 배양 루프를 통해 개별 군락을 골라 10 μL 무핵효소 물에 재현탁합니다. 이 현탁액 4 μL을 채취하여 2.7.1에 설명된 프라이머와 조건을 사용하여 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭 템플릿으로 사용한다.
- 2.7.3의 프로토콜에 따라 시퀀싱을 수행하고, 2.7.4에 포함된 절차를 사용하여 시퀀스를 검증합니다.
- 전체 DNA 추출, qPCR 정량화, 16S rRNA 증폭체 시퀀싱, RNA 추출, 전사체 프로파일링 등 추가 분석을 수행합니다.
참고: 유세포측 정량은 샘플링 직후에 수행되었습니다. 막 투과성 세포의 대조군으로는 70°C에 3분간 노출된 샘플을 사용했습니다. 배경 소음은 유세포검사법으로 박테리아 없이 세포 배양 모델에서 얻은 소화액 또는 샘플을 측정하여 평가하였다. 모든 샘플은 3배로 측정되었습니다.
표 1: 세포 배양 유지를 위한 세포주 및 배지 조성의 설명.
| 세포 배양 | 응속자/서스펜션 | 배양 매체 | 일반 보충 자료 | 특정 보충제 | 더블링 타임 | 잠복 조건 |
| Caco-2 (ECACC 86010202) | 신봉자 | 둘벡코 변형 이글 미디엄(DMEM) 포도당 4.5 g/L | 불활성화 태아 소 혈청(10% v/v) 페니실린 (100 U/mL)* 스트렙토마이신 (0.1 mg/mL)* 암포테리신 (0.0025 mg/mL)* | 글루타맥스 (4 mM) 비필수 아미노산 (1% v/v) 피루브산 (1 mM) | 65–72 시간 | 습도 95%,CO2 10%CO2 인큐베이터 ( 재료표 참조) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | 신봉자 | HEPES (1 mM) | 20–24 h |
| * 항생제와 항진균제는 분석 시작 2일 전에 세포 배양 배지에서 제거되었습니다. |
