박테리아 감염 탐지를 위한 잎에서 총 DNA 추출

초록

출처: 첸, H. 외. 감귤잎 조직 샘플에 대한 기존 PCR을 이용한 감귤 녹색 병원체 Candidatus liberibacter 속의 특이적이고 정확한 검출. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 병원성 박테리아에 감염된 감귤 잎 조직에서 전체 유전체 DNA를 추출하는 과정을 보여줍니다. 이 프로토콜은 체관에 제한된 병원체의 PCR 기반 후속 검출을 위한 신뢰할 수 있는 DNA 회수를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. 유전체 추출 키트를 사용하여 식물 조직에서 유전체 DNA 분리

1. 깨끗한 가위로 감귤나무에서 신선한 잎 한 장을 통째로 잘라내어 깨끗한 플라스틱 샌드위치 봉지에 담아 감귤 잎 조직을 얻으세요.
   참고: 잎 조직이 든 봉지는 수집 후 가능한 한 빨리 4°C 냉장고나 단열 용기에 넣어 얼음 위에 보관하여 부패를 방지해야 합니다.
2. 절구와 공을 식히기 위해 액체 질소를 소량 넣으세요. 식히는 동안 가위로 약 1평방인치 크기의 작은 잎 조직 조각을 잘라내세요. 잘린 티슈를 모르타르에 넣어 즉시 얼리게 하세요. 필요하면 액체질소를 더 추가하세요.
   참고: 액체 질소를 다룰 때는 항상 단열 장갑을 착용해야 합니다.
3. 모르타르를 사용해 식물 조직을 빠르게 곱게 갈아내세요. 액체 질소가 완전히 증발할 때까지 계속 분쇄하고, 미세한 녹색 가루가 남습니다.
4. 금속 주걱을 액체 질소에 잠시 냉각한 후, 주걱을 사용해 모르타르 안의 분쇄된 조직을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 담아 주걱으로 옮깁니다.
5. 1000 μL 피펫을 사용해 600 μL 핵 용해액( 재료표 참조)을 첨가합니다. 샘플을 1-3초간 소용돌이로 돌린 후 65°C 수조에서 15분간 배양합니다.
6. 10μL 피펫을 사용해 용해액 3 μL을 용해액에 추가하고, 튜브를 2에서 5번 뒤집어 혼합한 후, 캐비닛 인큐베이터에서 37 °C에서 15분간 배양합니다.
   참고: 혼합물을 실온까지 식힌 후 진행하세요.
7. 단백질 침전 용액 200 μL을 추가하고, 20초간 고속 소용돌이 가열한 후 13,000 x g에서 3분간 원심분리하여 단단한 펠릿을 만듭니다. 샘플을 원심분리하는 동안, 상온 이소프로판올 600 μL을 신선한 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 추가하세요.
8. 1000 μL 피펫을 사용해 원심분리된 샘플에서 상원액을 조심스럽게 제거하고, 이를 신선한 1.5mL 마이크로 원심분리관에 이소프로판올을 넣습니다. 이제 알갱이를 버려도 됩니다.
   참고: 상액을 단백질로 오염시키지 않도록 아주 소량의 상액만 남겨두세요.
9. 튜브를 뒤집어 DNA가 실 같은 가닥 덩어리로 보이게 한 후, 실온에서 13,000 x g에서 1분간 원심분리합니다.
10. 상청액을 디캔팅하고, 70% 에탄올 600 μL을 펠릿에 추가한 뒤, 튜브를 여러 번 뒤집어 DNA를 세척한 뒤, 13,000 x g에서 1분간 원심분리합니다.
11. 에탄올을 조심스럽게 흡입하여 느슨한 DNA 펠릿만 남기고, 튜브를 열어 뒤집어 흡수성 종이 위에 올려놓습니다. 실온에서 15분간 자연 건조하세요.
12. 건조된 DNA 펠릿에 100 μL의 DNA 재수화 용액을 첨가한 후, 65°C 물에서 1시간 동안 배양한 뒤, 튜브를 두드려 주기적으로 혼합합니다.
13. 정제된 물 1 μL을 마이크로큐벳에 넣고, 이를 분광광도계에 삽입하여 블랭크로 사용한다. 마이크로큐벳에 샘플 1 μL을 넣어 분광광도계에 삽입하여 DNA 농도를 계산합니다. DNA 농도(ng/μL)는 희석 인자 (A₂₆₀ -_{A 320}) × 50 ng/μL × 계산할 수 있습니다.
    참고: 여기서 프로토콜을 잠시 멈출 수 있습니다. 샘플은 4 °C에서 보관할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
위저드 유전체 DNA 정화 키트	프로메가	A1120	핵 용해, RNase, 단백질 침전, DNA 재수화 용액의 원천
액체 질소	에어 프로덕츠	해당 없음
5424 탁상용 원심분리기	에펜도르프	05-403-93
Isotemp 215 디지털 워터 배스	피셔 사이언티픽	15-462-15Q
금속 주걱	시그마-올드리치	Z283274
절구와 절구	시그마-올드리치	Z247464
LSE 보텍스 믹서	코닝	6775
2-프로판올	시그마-올드리치	19516
멸균 10 μL 팁	팁원	1161-3730
멸균 200 μL 팁	팁원	1163-1730
멸균 1250 μL 팁	팁원	1161-1750
가변 용량 피펫터 키트	VWR	75788-460
트리스 베이스	시그마-올드리치	10708976001
1.5 mL 마이크로 원심분리관	써모피셔 사이언티브	3439