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1. 유전체 추출 키트를 사용하여 식물 조직에서 유전체 DNA 분리
- 깨끗한 가위로 감귤나무에서 신선한 잎 한 장을 통째로 잘라내어 깨끗한 플라스틱 샌드위치 봉지에 담아 감귤 잎 조직을 얻으세요.
참고: 잎 조직이 든 봉지는 수집 후 가능한 한 빨리 4°C 냉장고나 단열 용기에 넣어 얼음 위에 보관하여 부패를 방지해야 합니다. - 절구와 공을 식히기 위해 액체 질소를 소량 넣으세요. 식히는 동안 가위로 약 1평방인치 크기의 작은 잎 조직 조각을 잘라내세요. 잘린 티슈를 모르타르에 넣어 즉시 얼리게 하세요. 필요하면 액체질소를 더 추가하세요.
참고: 액체 질소를 다룰 때는 항상 단열 장갑을 착용해야 합니다. - 모르타르를 사용해 식물 조직을 빠르게 곱게 갈아내세요. 액체 질소가 완전히 증발할 때까지 계속 분쇄하고, 미세한 녹색 가루가 남습니다.
- 금속 주걱을 액체 질소에 잠시 냉각한 후, 주걱을 사용해 모르타르 안의 분쇄된 조직을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 담아 주걱으로 옮깁니다.
- 1000 μL 피펫을 사용해 600 μL 핵 용해액( 재료표 참조)을 첨가합니다. 샘플을 1-3초간 소용돌이로 돌린 후 65°C 수조에서 15분간 배양합니다.
- 10μL 피펫을 사용해 용해액 3 μL을 용해액에 추가하고, 튜브를 2에서 5번 뒤집어 혼합한 후, 캐비닛 인큐베이터에서 37 °C에서 15분간 배양합니다.
참고: 혼합물을 실온까지 식힌 후 진행하세요. - 단백질 침전 용액 200 μL을 추가하고, 20초간 고속 소용돌이 가열한 후 13,000 x g에서 3분간 원심분리하여 단단한 펠릿을 만듭니다. 샘플을 원심분리하는 동안, 상온 이소프로판올 600 μL을 신선한 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 추가하세요.
- 1000 μL 피펫을 사용해 원심분리된 샘플에서 상원액을 조심스럽게 제거하고, 이를 신선한 1.5mL 마이크로 원심분리관에 이소프로판올을 넣습니다. 이제 알갱이를 버려도 됩니다.
참고: 상액을 단백질로 오염시키지 않도록 아주 소량의 상액만 남겨두세요. - 튜브를 뒤집어 DNA가 실 같은 가닥 덩어리로 보이게 한 후, 실온에서 13,000 x g에서 1분간 원심분리합니다.
- 상청액을 디캔팅하고, 70% 에탄올 600 μL을 펠릿에 추가한 뒤, 튜브를 여러 번 뒤집어 DNA를 세척한 뒤, 13,000 x g에서 1분간 원심분리합니다.
- 에탄올을 조심스럽게 흡입하여 느슨한 DNA 펠릿만 남기고, 튜브를 열어 뒤집어 흡수성 종이 위에 올려놓습니다. 실온에서 15분간 자연 건조하세요.
- 건조된 DNA 펠릿에 100 μL의 DNA 재수화 용액을 첨가한 후, 65°C 물에서 1시간 동안 배양한 뒤, 튜브를 두드려 주기적으로 혼합합니다.
- 정제된 물 1 μL을 마이크로큐벳에 넣고, 이를 분광광도계에 삽입하여 블랭크로 사용한다. 마이크로큐벳에 샘플 1 μL을 넣어 분광광도계에 삽입하여 DNA 농도를 계산합니다. DNA 농도(ng/μL)는 희석 인자 (A260 -A 320) × 50 ng/μL × 계산할 수 있습니다.
참고: 여기서 프로토콜을 잠시 멈출 수 있습니다. 샘플은 4 °C에서 보관할 수 있습니다.