<ol style="margin-top: 0in"><li> 꼬리 조각 (3mm)과 마크 귀를 컷. </li><li> 720m 리터 인트 30 M L Proteinase K (10 MG / ML 주식)을 추가합니다. </li><li> 55 품어 ° 가열 블록 및 와동 10 초 최고 속도로 3 시간 동안 매 시간에 C. </li><li> ° C 5 분 70 proteinase K를 Inactivate. </li><li> 5 분 얼음 끄다. </li><li> 최고 속도로 10 분 꼬리 DNA를 원심 분리기. </li><li> 720m 리터 이소프로판올를 포함하는 새로운 튜브에 가만히 따르다. &nbsp; </li><li> 반전 튜브 또는 vortexing으로 침전물의 DNA. </li><li> 최고 속도에서 5 분간 DNA를 스핀 다운. 뜨는 제거합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 전속력으로 게놈 DNA 5 분 스핀 다운. 뜨는 제거합니다. </li><li> DNA 1-2 분 동안 건조하실 수 있습니다. </li><li> 펠렛의 크기에 따라 100-200미터의 리터의 Resuspend의 DNA. </li><li> 55 플레이스 튜브 ° C 1 시간 동안 DNA의 해체를 촉진합니다. &nbsp; </li></ol>

마우스 뒷면에서 게놈 dna의 분리

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

이 쥐 새끼는 생후 10일 되었으며, 꼬리 생검을 수행한 후 꼬리에서 게놈 DNA를 추출할 것입니다. 우선 꼬리 끝부분을 약 3mm 정도 잘라낸 다음, 잘라낸 꼬리 조각을 에펜도르프 튜브에 넣고 해당 튜브를 드라이아이스 위에 올립니다. 이때 쥐 사이의 교차 오염을 방지하기 위해, 보통 면도날에서 마지막으로 절단한 지점을 표시해 둡니다.그런 방식으로 다음 마우스의 꼬리 생검을 수행할 때는 반드시 깨끗한 면도날 조각을 사용하겠습니다. 한 배에서 태어난 서로 다른 마우스들을 구분하기 위해서는 마우스들을 식별할 방법이 필요합니다. 한 가지 방법은 여기 보이는 이어 홀 펀처(ear hole puncher)를 사용하여 귀에 구멍을 뚫는 것입니다.마우스의 목덜미를 부드럽게 잡아 뒤집은 다음, 꼬리를 손가락 사이에 끼워 고정합니다. 다른 쪽 손으로 귀 펀치를 잡고 마우스의 귀 부분을 빠르게 뚫어줍니다. 통증 없이 진행된 것을 확인하십시오.이제 이p-tube에 꼬리 조각들이 들어 있는 것을 볼 수 있습니다. 이제 소화를 돕는 용액들을 추가하겠습니다. 먼저 STE 용액 720 µL를 넣고, 이어서 Proteinase K 30 µL를 추가하겠습니다. 여기 소화 전 단계에서 절단한 꼬리 조각의 모습이 있습니다.이제 꼬리 조각들을 55°C 가열 블록에 놓겠습니다. 많은 프로토콜에서 55°C에서 지속적으로 흔들어주는 록킹(rocking) 방식을 요구하지만, 여기서는 꼬리 조각들을 볼텍싱(vortexing)할 예정이므로 그럴 필요가 없습니다. 이제 꼬리 조각을 2초 동안 볼텍싱하겠습니다.하나, 둘. 볼텍싱 후, 여기 에펜도르프 튜브 내부의 상태를 보시면 꼬리 조각이 완전히 용해된 것을 확인할 수 있습니다. 70 °C에서 5분 동안 proteinase K를 활성화하십시오. 얼음 위에서 5분 동안 냉각하여 반응을 중단시키십시오.마이크로 원심분리기를 사용하여 꼬리 부분을 최대 속도로 10분 동안 원심 분리하십시오. 이 마이크로 원심분리기의 최대 속도는 13,000 RPM입니다. 소화된 꼬리 부분이 원심 분리되는 동안, 몇 개의 에펜도르프 튜브에 라벨을 붙이고 750 µL의 이소프로판올을 채우십시오.소화된 꼬리 조직을 원심분리하면 털과 소화되지 않은 물질이 튜브 바닥에 펠렛 형태로 형성되므로 상층액을 따라냅니다. 소화된 물질, STE 및 proteinase K가 포함된 용액을 isopropanol이 들어있는 eppendorf 튜브에 넣으면 DNA가 용액에서 석출되기 시작하며, 유령이나 깃털 같은 모습으로 나타납니다. 바로 저렇게 떠다니는 거품 같은 것이 마우스 꼬리에서 분리된 genomic DNA입니다. isopropanol과 STE 용액을 혼합한 후, genomic DNA가 용액에서 석출되어 여기 보이는 작은 공 모양으로 나타나게 됩니다. 침전된 genomic DNA를 마이크로 원심분리기로 최고 속도에서 5분 동안 원심분리합니다.튜브 바닥에 펠릿 형태의 게놈 DNA가 보입니다. 이제 튜브 내부의 용액을 흡입하여 제거하고 게놈 DNA 펠릿만 남기겠습니다. 다른 튜브를 흡입할 때마다 팁을 교체하겠습니다.이 흡입기 팁 끝에 팁을 끼웁니다. STE와 이소프로판올을 흡입하여 제거한 후, genomic DNA 펠렛을 세척하기 위해 70% ethanol 1 mL를 첨가합니다. genomic DNA 펠렛은 보통 마이크로 원심분리 튜브 벽면에 달라붙어 70% ethanol에서 완전히 세척하기 어렵기 때문에, 여기 있는 마이크로 원심분리 튜브 랙에 튜브를 긁어 펠렛을 떼어내야 합니다.이런 방식으로 진행하면 됩니다. 여기 70% ethanol로 펠렛화하고 세척한 후의 genomic DNA 모습입니다. 다시 최대 속도로 5분 동안 원심분리한 다음, 70% ethanol을 흡입하여 제거하고 세척된 genomic DNA 펠렛을 원심분리합니다.70% ethanol을 넣고 5분 동안 최대 속도로 원심분리한 후, 70% ethanol을 흡입하여 제거하고 DNA를 5분 동안 건조시킵니다. 튜브 바닥에 있는 genomic DNA 펠렛을 확인하면, 원하는 정도로 충분히 건조된 상태입니다. 이제 마우스 꼬리에서 추출한 genomic DNA 펠렛을 건조했으므로, pH 8의 40 mM Tris 100 µL를 첨가하겠습니다.따라서 genomic DNA를 50 °C에서 보관하는데, 이렇게 하면 상온에서보다 더 빠르게 용해됩니다. 50 °C에서 약 1시간 정도 지난 후, PCR 반응을 통해 어떤 마우스가 내 transgene에 대해 양성인지 확인할 때까지 이를 냉동 보관하거나 4 °C에 둡니다.

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

이 논문에서

프로토콜

재료

재인쇄 및 허가

태그

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
STE	완충액			100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / in H2O
TE	완충액			100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl