히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

요약

분자 프로브 PicoGreen 염료와 microplate 리더 액세서리를 갖춘 히타치 F - 7000 형광 분광 광도계를 사용하여 dsDNA의 부량의 데모.

초록

특히 작은 농도의 DNA,의 부량는 합성과 정화의 DNA 등 유전자 증폭 제품의 부량 등 진단 응용 프로그램 및 약물의 DNA 분자의 탐지와 같은 표준 분자 생물학의 assays 포함하여 생물 학적 응용 프로그램의 다양한 중요한 작업입니다 준비. 이 비디오를 동안 우리는 분자 프로브 퀀트 - 그것 PicoGreen 염색 시약 키트를 사용하여 dsDNA의 부량을 수행하는 마이크로 플레이트 리더 액세서리 갖춘 히타치 F - 7000 형광 분광 광도계의 능력을 보여주는 것입니다.

F - 7000 형광 분광 광도계는 고감도 및 고속 측정을 제공합니다. 그것은 측정 형광, 발광과 인광 수있는 매우 유연한 시스템입니다. 몇 가지 측정 모드 파장 스캔, 시간 검색, 측광 및 3 - D 검사 측정을 포함하여, 사용할 수 있습니다. 분광 광도계는 microplate에 300 μL 샘플 볼륨을 사용할 때 플루오레신 50 picomoles의 범위에서 감도를 가지고 있으며, 60,000 NM / 분의 스캔 속도를 측정할 수있다. 또한 최대 농도의 넓은 범위의 보정 곡선의 사용을 허용 규모의 5 주문 다양한 동적 범위가 있습니다. 광학 시스템은 최대 에너지와 감성에 대한 모든 반사 광학을 사용합니다. 표준 파장 범위는 200-750 nm의이며, 옵션 근처 적외선 photomultipliers 중 하나를 사용할 때 900 nm의로 확장될 수 있습니다. 이 시스템은 옵션으로 외부 온도 조절 액체 순환 장치를 사용하여 섭씨 5-60도에서 플레이트 리더를위한 선택 온도 제어를 허용합니다. microplate 리더 96 잘 microplates의 사용을 허용하고, 반응 속도론 모드를 사용하는 경우 96 우물에 대한 측정 속도보다 60 초입니다.

F - 7000 및 Microplate 리더를위한 소프트웨어 컨트롤도 매우 유연합니다. 샘플은 열 또는 행에 형식 중 하나에서 설정 수 있으며, 우물의 조합은 샘플 측정 선택할 수 있습니다. 이것은 microplate의 최적 활용을 허용합니다. 또한, 소프트웨어는 마이크로 Excel에서 만든 쉼표로 구분된 값에 저장된 판 샘플 구성 또는 "CSV"포맷을 가져올 수 있습니다. Microplate 측정 구성이 저장되고 편의를위한 소프트웨어 및 생산성 향상으로 리콜 수 있습니다. 데이터 결과는 표준 보고서 출력, 엑셀로, 또는 선택적 보고서 생성기 프로그램을 수 있습니다.

프로토콜

1. 악기 설정

1. spectrofluorometer 켜고 1 시간 동안 워밍업 수 있습니다.
2. Excel이 그림 1에 나타난 표준 및 샘플 데이터 파일을 만들고 분리 쉼표에 저장 사용하면 "CSV"형식을 값.
   
   
   그림 1. 표준 및 샘플 데이터입니다.
   
   
3. 다음과 같이 fluorometer를 설정합니다 :
   1. 을 클릭 버튼이 그림 2에 표시된 분석 방법 창이 열립니다.
      
      
      그림 2. 분석 방법 윈도우, 일반 탭을 클릭합니다.
      
      다음과 같이 선택합니다 :
      • "측정"필드에서 풀다운 메뉴에서 측광을 선택합니다.
      • "연산자"입력란에 해당 운영자의 이름을 입력합니다.
      • "악기"입력란에 정보를 입력할 필요가 없습니다. 이것은 소프트웨어에 의해 자동으로 선택됩니다.
      • microplate 리더를 사용할 때 "샘플링"필드는 비활성화되어 있습니다.
      • 당신이 "의견"입력란에 리포트에 포함시킬 수있는 의견을 입력하십시오.
      • "액세서리"입력란에이 시험에 사용되는 부속품에 관한 정보를 입력하십시오.
      • 창의 오른쪽에있는 버튼을합니다.
      • "로드"버튼을 이전에 저장한 분석 방법을 로딩 있습니다.
      • '저장'버튼은 동일한 이름을 사용하여 테스트 매개 변수 또는 이전에 저장한 및로드 분석 방법의 집합을 업데이 트하실 수 있습니다.
      • 버튼을 원하는 이름으로 테스트 매개 변수 또는 분석 방법의 새로운 집합을 저장 가능 "다른 이름으로 저장".
      이제 "Quantitation"탭을 클릭, 그림 3을 참조하십시오 다음과 같은 선택합니다.
      
      
      그림 3. 분석 방법 윈도우, Quantitation 탭.
      
      • "Quantitation 형식"입력란에 파장을 선택합니다. 이것은 형광 읽기가 선택한 파장을 사용하여 이루어집니다 나타냅니다.
      • "보정 형식"입력란에 1 ^{일 순서를} 선택합니다.
      • "파장 번호 '입력란에 1을 선택합니다.
      • "농도 단위"필드에서 NG / ML을 입력하십시오.
      • "수동 보정"와 "제로를 통해 강제로 곡선"에 대한 확인란을 선택되지 않은 둡니다.
      • 입력란에 "소수점 뒤 자리"에서는, 2를 선택합니다.
      • "로우어 농도 제한"필드에 0을 입력합니다.
      • "어퍼 농도 제한 필드에 10000을 입력합니다.
      
      이제 '악기'탭을 클릭하고 다음과 같이 선택합니다.
      
      
      그림 4. 분석 방법 창, 인스 트루먼트 탭
      
      • "데이터 모드 :"입력란에 형광을 선택합니다.
      • "초핑 속도"필드는이 시간에, 그것이 인광 측정에 대해서만 사용되는 운영 중지 상태입니다.
      • "파장 모드"필드에서 WL 고정 모두를 선택합니다.
      • "EX / WL1 '입력란에 480nm 입력하십시오.
      • "EM / WL1"필드에서 520nm를 입력하십시오.
      • 다른 모든 EX 아래의 필드와 EM은 현재 운영 중지 상태입니다.
      • "EX 슬릿 '입력란에 풀다운 메뉴에서 5.0nm 선택합니다.
      • "EM 슬릿 '입력란에 풀다운 메뉴에서 5.0nm 선택합니다.
      • "PMT 전압 1 - 1000V '필드 앞에있는 확인란을 선택되지 않은 둡니다.
      • "PMT 전압"필드에서 풀다운 메뉴에서 700V를 선택합니다.
      • "자동 통계 CALC. 번호"입력란에 2를 선택합니다.
      • "복제"입력란에 1을 선택합니다.
      • "통합 시간"필드에서 0.1s를 선택합니다. <은/ 리>
      • "지연"입력란에 입력하거나 개로 선택하십시오.
      '모니터'탭을 클릭하십시오.
      
      
      그림 5. 분석 방법 창, 모니터 탭을 클릭하십시오.
      
      • "Y 축"에서 "최대 :"입력란에 10000을 선택합니다
      • 에서 "Y 축", "최소 :"필드에 0을 선택합니다.
      • "데이터 수집 후 처리 오픈 데이터"의 왼쪽에있는 확인란을 선택합니다.
      • 이 수치가 완료된 후 자동으로 인쇄하기 위해 리포트를 원하지 않으시면 '데이터 수집 후 인쇄 보고서 "의 왼쪽에있는 확인란을 선택되지 않은 둡니다.
      '보고서'탭을 클릭, 그림 6을 참조하십시오.
      
      
      그림 6. 분석 방법 창, 보고서 탭.
      
      • "출력"필드에서 풀다운 메뉴에서 인쇄 보고서를 선택합니다. 당신은 또한 사용자 정의 만든 리포트를 생성할 수 있습니다 프로그램 보고서 생성기에 선택 추가를 사용하는 경우 Excel로 내보낸 데이터 또는 "사용 인쇄 생성기 시트"를 원한다면 "Microsoft Excel을 사용"을 선택 수 있습니다.
      • 이 보고서에 포함 시키고자하는 항목에 대한 상자를 클릭합니다.
      • "분석 방법"윈도우의 여러 탭에서 선택한 모든 매개 변수를 저장하려면, ""일반 "탭을 다시 클릭하고 파일 이름으로하고 나중에 사용하기 위해 그것들을 찾을 수있는 위치에 그들을 저장하고,를 클릭 확인 "이 창을 닫습니다 버튼을 누르십시오.
      • 이것은 악기 테스트 매개 변수를 설정 완료됩니다.
      • 이제 우리는 microplate 리더를 설치합니다.
      • 을 클릭 위에 MPR 설치 윈도우가 나타납니다 버튼.
      그림 7에 표시된 MPR 설치 윈도우 / 플레이트 탭에서 표준 및 샘플을위한 우물을 선택합니다.
      
      
      그림 7. MPR 설정 창, 플레이트 탭을 클릭하십시오.
      
      • A1 위치를 클릭하고 E1 마우스를 드래그 다음을 클릭합니다 버튼을 클릭합니다. 이것은 표준에 사용되는 위치를 선택합니다. 이러한 순위는 녹색으로 강조 표시됩니다.
      • 이제 우리는 샘플 H3에 위치의 F1을 선택합니다. 를 누른 다음를 클릭하고 위치 F1부터 마우스를 드래그 H3 위치를하고 버튼이 노란색으로 그 위치를 강조 표시됩니다.
      • 다음 샘플 측정에 그 위치를 선택하고, E3에 A2 위치에 대해 동일한 작업을 반복합니다.
      • 이제 변수 (CSV) 파일을 구분된 파일 쉼표로 표준 및 샘플 정보 사전에 준비를로드하자.
      그림 8 표시된 "MPR 설정 창"의 "자 정보"탭을 클릭합니다.
      
      
      그림 8. MPR 설정 창, 웰 정보 탭을 클릭하십시오.
      
      • 다음을 클릭합니다 버튼을 클릭합니다. Windows 탐색기 창을은 "글쎄 information.csv"파일을 찾는 데 그것을 로딩 있도록 그림 9에 표시하는 열립니다.
        
        
        그림 9. 물론 샘플 정보를로드 중입니다.
        "자 정보"파일을로드 후 "그럼 정보는"그림 10에서 그림과 같이 표시됩니다
        
        
        그림 10. 샘플 잘 정보를 로드된.
        

2. Picogreen 분석 샘플 준비

1. 20 X TE 버퍼 1 ML 추가하여 1X TE 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 준비19 ML DI H ₂ O.
2. 9.95 ML 1 X TE 버퍼 50 μL 200 X PicoGreen 시약을 추가하여 PicoGreen 시약 솔루션을 준비합니다.
3. 주식 dsDNA (100 μg / ML)의 시리얼 dilutions함으로써 표준 (람다 dsDNA)를 준비합니다. 먼저 주식 dsDNA (100 μg / ML) 25 μL 1 X TE 버퍼 25 μL를 추가하여 50 μg / ML dsDNA의 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 아래의 표에 표시된 dsDNA의 볼륨과 버퍼를 추가하여 표준 솔루션을 준비 :

   dsDNA의 농도	dsDNA의 볼륨	버퍼의 볼륨
   1 μg / ML	50 μg / ML dsDNA 20 μL	980 μL 1 X TE 버퍼
   0.1 μg / ML	1 μg / ML dsDNA 100 μL	900 μL 1 X TE 버퍼
   0.01 μg / ML	0.1 μg / ML dsDNA 100 μL	900 μL 1 X TE 버퍼
   0.001 μg / ML	0.01 μg / ML dsDNA 100 μL	900 μL 1 X TE 버퍼

3. 표준 및 샘플 형광 측정

1. 피펫 150 그림 7 당 96 잘 접시의 우물 A1 - E1에 각 표준의 μL, 다음과 같은 테이블에 따라 :

   잘	표준
   A1	1 μg / ML
   B1	0.1 μg / ML
   C1	0.01 μg / ML
   D1	0.001 μg / ML
   E1	1 X TE 버퍼

2. 그림 7에 표시된 H3에 우물 F1에 피펫 150 μL 알려지지 않은 샘플
3. 다중 채널 피펫 사용을 위해 설계된 여물로 단계 1.2 준비 PicoGreen 솔루션을 하거라. 웰스 A1 - H3 150 μL PicoGreen 솔루션을 제공하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 부드럽게 피펫과 혼합 용액 및 표준.
4. 플레이스 어두운 영역 판과 발전에 대한 반응에 대한 2-5분을 기다립니다.

4. 대표 결과

좋은 교정 곡선은 소프트웨어에 의해 보정 곡선의 표준과 계산 측정시 F - 7000 소프트웨어에서 제공하는 다양한 매개 변수를 사용하여 평가됩니다.

결정 계수는 측정 기준에 맞게의 선하심과 계산 보정 곡선을 나타냅니다. 가까이이 값이 "1"로되어 측정값 및 교정 곡선의 더 맞습니다.

값이 "1"에서 멀리 떨어진 경우, 기준, 다시 측정 다시 준비하거나 교정 곡선의 적합성은 변경해야합니다.

그림 11 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량 위해 얻은 계산 결정 계수 = 0.99993와 교정 곡선의 예를 보여줍니다.

그림 11. dsDNA 보정 곡선의 예.

토론

조심하세요 샘플 준비 중에 pipetting뿐만 아니라 안정적이고 민감한 형광 분광 광도계를 사용하여 좋은 재현성 결과를 얻기 위해 필수적입니다.

이 테스트에 사용된 형광 분광 광도계의 경우, 그것은 microplate 리더 300 μL 최종 샘플 볼륨을 사용하여 제안합니다. 낮은 볼륨 감도를 감소하고, 큰 볼륨 우물 사이의 교차 오염의 원인이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약		P7589
/n 237108	공급		237108
12 채널 Eppendorf 마이크로피펫	공급		3516677
1000 μ L Eppendorf 피펫	공급
200 μ L Eppendorf 피펫	공급
10 mL 혈청 학적 피펫	공급
알루미늄 호일	공급
피펫 팁	공급
Hitachi F-7000 형광 분광 광도계 FL 솔루션 2.1	장비		5J1-0003
마이크로 플레이트 리더 F-7000	장비		5J0-0139