$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 곤충
- 배꼽 orangeworm, Amyelois transitella (워커) (Lepidoptera : Pyralidae) 프레스노, 캘리포니아 아몬드 나무에서 수집된 나방에서 유래 우리 연구실에 식민지. 우리 곤충의 식민지가 28 환경 챔버 (퍼시벌 병원, IA)에 유지됩니다 ± 2 ° C, 75 ± 10 % 상대 습도, 그리고 16시 8분 H 이하 (조명 : 어두운) 사진 정권.
- 신흥 나방은 sexed, 매일 수집, 플라스틱 상자 (669 ML 도시락, 13 X 13cm, 높이 4.5 cm, Rubbermaid)으로 전송됩니다 물에 젖었을 종이 타올 10 레이어 (함께 최대 제공 썰스티 울트라 흡수제, 27.9 X 27.9 cm ; 세이프). 박스 커버는 공기 순환을 허용하는 구멍이 있습니다. 이 협정 ~ 100 % RH를 제공합니다.
- electrophysiological 측정 우리는 높은 습도에 따라 보관 출현 이후 2-4일에게 이전 나방을 사용합니다.
2. Electrophysiological 준비
- 나방 (남성 또는 여성)이 부드럽게 대형 (ca. 2mm) 팁 직경을 가지고 가기에서 절단하는 피펫 팁 (200 μL, 미국 과학 부동산)에 적용됩니다. 안테나와 머리 부분 끝에서 내다까지 나방은 부드럽게 humidified 티슈 스텁과 다른 쪽 끝을 통해 밀고있다.
- 노출된 머리는 한 눈 두 안테나 노출의 작은 부분을 떠나는가 아닌 건조 점토 (Claytoon, 반 아켄 국제, CA)으로 머리를 덮고으로 움직일 수 있습니다. 이 준비는 두 전극 홀더 사이 EAG Micromanipulator MP - 12 (Syntech, 독일)의 플랫폼에 배치됩니다.
- 우리는 필라멘트와 1.0 mm borosilicate 모세관 튜브 (WPI 병원, FL)에서 만든 마이크로 미터 팁 미만의 microelectrodes를 얻는 모델 P - 97 micropipette 풀러 (셔터 인 스트 루먼트, CA)에서 가져온 유리 전극을 사용합니다. 전극 다시 sensillum 림프 울리는 (Kaissling 및 쏘슨 1980)로 가득합니다. 기록 전극은 두 안테나를 수용하면서 하나의 전극은 현미경 (Leica MZ75)에서 안구의 노출된 영역을 impales 및 참조 역할을합니다. 연락처를 촉진하기 위해 말초 1-2 antennal 구간은 기록 전극에 삽입되기 전에 절단됩니다. 개인 sensilla에서 녹음 신호를 위해, 우리는 약간 기록 전극은 현미경 (; 800x 배율 올림푸스 BX51WI) 아래 찔려 죽은 것입니다 궁극적이 설정을 수정합니다. 액션 잠재력은 sensillum의 기지에서 유리 전극을 삽입하여 기록됩니다. 신호 AUTOSPIKE 소프트웨어 (Syntech, 독일)로 분석하는 UB - IDAC 오프라인에 높은 임피던스 사전 증폭기 (Syntech, 독일)와 공급에 의해 증폭됩니다. AC 신호는 100 Hz에서 -10,000 및 행동 잠재력 사이의 필터링 밴드 패스 아르는 소음으로부터 피크 - 투 - 트러프 amplitudes 구별 AUTOSPIKE 알고리즘을 사용하여 컴퓨터에서 추출됩니다. 개별 뉴런의 반응은 자발적인 주파수를 통해 실천 가능성 주파수의 증가 (또는 감소) (초당 스파이크)로 계산됩니다.
3. 화학 자극 자극 프로토콜
- 높은 순도의 화학 물질이 사용됩니다. 배꼽 orangeworm에서 여성 페로몬의 조화의 주요 구성 (Z, Z) -11,13 - hexadecadienal이 Bedoukian 연구 병원, CT로부터 얻은 것입니다. 화학 물질이 희석 아르, 10 μg / μL 및 decadic dilutions 재고 솔루션을 만들기 위해 유리 소주 헥산과 W / V가 만들어집니다. 헥산에 녹아있는 자극 화학 나누어지는 (10 μL)이 왓먼 필터 종이 스트립 (8x40 ㎜)에 로드된, 용매는 부드럽게 퓸 후드 아래에 10 S에 대한 흔들어에 의해 증발되고 스트립은 5 ML의 폴리 프로필렌에 배치됩니다 주사기는 (BD 주사기, NJ)있는 다양한 볼륨이 배출됩니다. 헥산 혼자와 빈 주사기는 컨트롤 역할을합니다.
- 준비가 Syntech의 자극 컨트롤러 (CS - 55 모델, Syntech, 독일)에 의해 전달되는 humidified 공기 흐름에서 개최됩니다 20 ML / 초 수있는 ML / s의 500 MS에 대한 추가 4 자극 펄스. 신호는 자극 펄스의 시작 전에 2 S를 시작, 10 s에 대한 기록됩니다. Antennal 준비 500 MS 펄스와 함께하는 CA 동안 자극합니다. 자극을 포함하는 5 ML의 폴리 프로필렌의 주사기에서 공기 정화 2 ML은 주요 공기 흐름에 추가됩니다. 높은 응답을 다음과 같은 최소한 1 분 이상의 격차는, stimulations 사이에 허용됩니다.
4. 대표 결과
구속 나방의 안테나 (그림 1) 여성 페로몬 성분과 자극, (Z, Z) -11,13 - hexadecadienal 강력한 선량에 의존 반응 (그림 2)를 생성합니다. 이 주요 페로몬 구성 요소는 또한 하나의 단위 기록 (그림 3B)의 흔적이 표시 긴 trichodea sensilla (그림 3A)에서 선량 의존 흥분성의 응답을 elicits.
그림 1. 노출 배꼽 orangeworm 나방 구속과 안테나를 라이브
load/2489/2489fig2.jpg "고도 ="그림 2 "/>
그림 2. 선량 의존 EAG의 응답에 대한 응답으로 elicited (Z, Z) -11,13 - hexadecadienal, 주요 여성 페로몬 성분.
그림 3. 남성의 배꼽 orangeworm 나방의 Sensilla의 trichoid는 응답 (Z, Z) 복용에 의존 방식으로 -11,13 - hexadecadienal. (A) 남자 배꼽 orangeworm 나방의 안테나는 다중 분할하고 각 세그먼트는 구조물 같은 머리의 많은, sensilla로 장식되어있다. 의 세부 정보를 보여주는 스캐닝 전자 현미경, 삽입된 페이지 (스케일 바는 각각 200 및 50 μm의됩니다.) trichoid sensillum에서 (B) 세포 단일 단위 녹음.