효모 콜로니 임베딩 방법

Summary

빛과 전자 현미경에 대한 sectioning 수 있도록 효모 식민지를 포함하는 방법. 이 프로토콜은 곰팡이 지역 사회 내에서 세포 유형의 조직을 이해하는 방향으로 새로운 도구를 제공하는 식민지 이내 sporulated 세포 pseudohyphal 세포의 분포의 결정 수 있습니다.

Abstract

배아 다른 세포 유형의 Patterning는 metazoan 개발에 중요한 메커니즘입니다. 이러한 식민지와 biofilms과 같은 미생물의 커뮤니티는 세포 유형의 패턴을 표시합니다. 예를 들어, 효모의 S. cerevisiae는 sporulated 세포 pseudohyphal 세포 균일 식민지에서 배포되지 않습니다. patterning 이러한 패턴을 기초 분자 메커니즘의 기능 중요성은 아직도 제대로 이해하고 있습니다.

곰팡이 식민지의 세포 유형의 패턴을 조사에 관한 한 과제는 metazoan 조직과는 달리, 식민지의 세포가 상대적으로 약하게 서로 연결된 것입니다. 특히, 곰팡이 식민지는 대부분의 조직에서 발견 세포외 기질 같은 광범위한 수준을 포함​​하지 않습니다. 여기이 식민지에서 세포 유형의 내부 패턴을 보여줍니다 효모 식민지를 포함하고 sectioning하는 방법에 대한 리포트입니다. 방법은 가벼운 현미경 및 전송 전자 현미경에 적합한 얇은 섹션 (0.1 μ)에 유용 (0.5 μ) 두꺼운 부분을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 세포의 내부 구조가 EM으로 시각 수 있지만 Asci과 pseudohyphal 세포는 쉽게, 가벼운 현미경으로 난형의 효모 세포를 구분할 수 있습니다.

방법은 한천과 식민지를 둘러싼 스퍼의 중간 그들을 침투하고, 다음 sectioning을 기반으로합니다. 1~2mm의 범위에있는 직경이 식민지는이 프로토콜에 적합합니다. 식민지의 내부를 시각화뿐만 아니라, 방법은 기본 한천을 침공 식민지 지역의 시각화 수 있습니다.

Protocol

1. 콜로니 분리 및 고정

1. 표시된 시간을 한천 배지에 300 식민지 (격리 식민지가 직경 1~2mm한다) 알을 품다.
2. 콜로니 (얼굴까지)와 좁은 주걱을 사용하여 기본 매체를 제거합니다.
3. 2 % 한천의 여러 방울을 플레이스 42 ° C가 굳은 한천 전에 얼굴 1 ML pipetman 팁 즉시 장소 식민지를 사용하여 현미경 슬라이드에.
4. 42 ° C 식민지에서 2 % 한천의 여러 방울을 넣고 응고 수 있습니다.
5. 이 프로토콜의 나머지 부분을 통해 모든 단계에 대한 장갑을 착용
6. 트림 면도날로 블록과 4에서 7 일 동안 2 % paraformaldehyde / 2 % 글루 타 알데히드 정착액을 포함하는 3.5 ML borosilicate 나사 캡 병에 넣어 ° C.

2. 세척 및 오스뮴 트리 트먼트

1. 약 1 주 후, 완전히 동일한 볼륨 5 분 후 식민지 (약 1.5 ML) 두 번 이상을 감추기에 충분 할만큼 0.15M 나트륨 cacodylate (산도 7.2)로 15 분 동안 두 번 잠복기에 의해 화학 퓸 후드 아래에 얼음 한천 블록을 씻어 1X OS 버퍼 (100 MM KH ₂ PO _....

Discussion

제출 방법은 식민지의 내부 구조를 보여준다. 방법은 S.의 범위의 셀 유형의 패턴을 결정하는 효과가 있기 때문에 다른 콜로니 morphologies로 cerevisiae의 변종, 또한 관련 종 S. paradoxus ^5, 방법은 곰팡이와 다른 미생물의 다양한에서 작동 가능성이 높습니다.

방법의 성공을 위해 한 중요한 단계는 식민지의 상단을 포함한 전체 식민지는, 프로토콜에 걸쳐 한천으로 쌌다는 것을 보장하는 것입니다. 식민지 한천 완전히 쌌다 여부는 toluidine과 청색의 빛을 현미경과 얼룩에 대한 sectioning 후 결정하실 수 있습니다. 얼룩진 부분이 빛을 현미경으로 볼 때, 한천 배지는 포함 매체보다 약간 어두운 얼룩이다. dehydrations 단계 중에 한천 축소, 전체 식민지를 복구하기 위해서는 반드시 그 이유는 1) 안정 단계 1.2의 식민지를 충당하기 위해 한천의 4-5 방울을 추가하고, 2)하지에 오직.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
오스뮴 테트록사이드	전자 현미경 과학	RT 19152
실리콘 임베딩 몰드	Fisher Scientific	NC 9975029
Cycloaliphatic 에폭사이드 수지	전자 현미경 과학	RT 15004	ERL 4221
에폭시 수지	전자 현미경 과학	RT 13000	DER 736
노닐 숙신산 무수물	전자 현미경 과학	RT 19050	NSA
2-디메틸 아민– thanol	Electron Microscopy Sciences	RT 13300	DMAE
마운팅 미디어	KPL Inc	71-00-16
회전 휠	Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
마이크로톰	라이카 마이크로시스템즈	울트라컷 S