국소 빈혈에 의한 급성 신장 손상에 대한 정확한 murine 모델 (아키)는 급성 신장 부상을 조사하고 가능한 신장 부상을 치료하는 치료 도구를 찾는 중요한 도구입니다. 걸려 체중이 시스템은 신장 혼잡을 유발하지 않고 즉각적이고 안정적인 신장 동맥 폐색 및 reperfusion위한 도구를 제공합니다.
이 논문에서
요약
초록
입원 환자에서 급성 신장 상해 (아키)의 경우 50 % 이상이 1-3 신장 국소 빈혈로 인해 발생합니다. 입원 환자의 최근 연구는 혈청 크레아티닌 수준에서만 약한 증가 (0.3-0.4 MG / DL)에 증가 하나없는 사람에 비해 사망 70 % 더 큰 위험과 연관된 것으로 나타났다. 다음 행과 함께, 수술 절차는 필요한 교차 클램핑 대동맥과 신장 혈관의 상태가 30 % 4 신장 장애 속도로 연결됩니다. 마찬가지로, 심장 수술 후 아키는 정상적인 상황에서 환자의 10 % 이상에서 발생하고 사망률을 극적으로 증가와 연결되어 있습니다. 아키는 간 이식 후 일반적인 합병증입니다. 환자의 적어도 8~17%는 신장 대체 요법 5 필요한 결국. 또한, 신장 이식 중에 가느다란 관 세포 손상으로 인해 지연 그래프트 기능은 자주 국소 빈혈 - 관련 아키 6 관련이 있습니다. 또한, 아키는 패혈증 6 고통 환자의 약 20 %에서 발생합니다. 아키의 발생이 병적 상태와 사망률 1 극적인 증가와 연결되어 있습니다. 치료 방법은 매우 제한되어 있으며, 아키에 interventional 재판의 대부분은 인간에 실패했습니다. 따라서, 국소 빈혈에서 신장 손상을 방지하기 위해 추가적인 치료 modalities는 다급하게 7-9, 3 필요합니다.
국소 빈혈에 의한 신장 손상의 메커니즘을 가능한 치료 전략 murine 모델을 명료하게하다하려면 집중적으로 7-13 필요합니다. 마우스 모델은 유전자 타겟 마우스 및 조직 특정 유전자 타겟 생쥐 (CRE - flox 시스템)를 포함한 다른 유전자 모델을 활용 가능성을 제공합니다. 그러나, murine 신장 국소 빈혈은 기술적으로 도전하고 실험 내용은 상당히 결과에 영향을 미칩니다. 우리는 특별히 신장 작은 꽃자루 14 클램핑 또는 suturing의 사용을 피할 생쥐에서 분리된 신장 동맥 폐색에 대한 새로운 모델의 체계적인 평가를 수행했습니다. 국소 빈혈에만 실험 설정 주도록 신장을 수행할 수 있으므로이 모델은 오른쪽 신장의 신이 필요합니다. 사실, 교수형 - 중량 시스템을 사용하여 신장 동맥은기구는 수술을 통해 한 번있다. 또한, 더 정맥 또는 요도 방해는이 기술을 발생하지 않습니다. 우리는 혈청 크레아티닌을 측정하여 국소 빈혈과 시간 선량에 의존하고 높은 재현성 신장 부상을 보여줄 수 있습니다. 또한, 허혈성 preconditioning하여 전체 작은 꽃자루, 신장 보호 종래의 고정이 새로운 모델을 비교할 때 더 깊고 더 신뢰할 수 있습니다. 따라서 그의 새로운 기술은 급성 신장 손상의 분야에서 작업하는 다른 연구자에 대한 유용할 수 있습니다.
프로토콜
일반 비고. 모든 작업은 직립 해부 현미경 (Leica) 미만 수술 coagulator를 사용하여 수행되어야합니다. 실험 그룹의 생쥐는 결과의 comparability을 보장하기 위해 연령과 체중에 일치해야합니다. 온도, 혈압, 마취 및 유체 행정부는 실험 기간 동안 안정적이고 모니터링해야합니다.
1. 마취 및 수술
- 신장 국소 빈혈의 실험 중 동시에 신장에 국소 빈혈과 reperfusion을 적용하거나, 남아있는 신장의 국소 빈혈 치료와 함께 하나의 신 이후로 수행할 수 있습니다. 두 신장의 양자 국소 빈혈의 치료가 증가하고 기술적인 문제, 좀 더 복잡한 실험 설정과 긴 수술과 관련된, 우리가 매달려 체중 시스템을 이용하여 나머지 왼쪽 신장의 국소 빈혈 치료에 의해 다음 오른쪽 신을 수행합니다. 우리는 마음에 관상 동맥 폐색 또한이 걸려 체중이 시스템을 활용. 관상 동맥은 심장 근육 내에 자리잡고 반면 신장 동맥이 주변 조직으로부터 격리 될 수 있기 때문에 그러나, 절차는 다릅니다.
- 마우스 (8-14 세 주 중 섹스는) 70mg/kg의 투여에 pentobarbital과 anesthetized 것입니다. 우리는 약과 마취를 유지합니다. pentobarbital 10 MG / kg / H 나트륨. 도달 했나봐 크게 혈압을 낮출 수 있으며, 따라서 그 결과를 변경할 수 있습니다. 우리의 초기 연구에서 우리는 또한 케타민을과 xylazine를 사용합니다. 그러나 이러한 화합물은 강력한 bradycardia (150 / 분)을 유도. 관찰된 bradycardia 옆에 두 화합물은 국소 빈혈의 조건 중에 보호 메커니즘에 관여하는 증거도있다. 휘발성 anesthetics 또한 신장 보호와 낮은 혈압을 유도하거나 자신의 능력으로 인해 사용할 수 없습니다. 따라서 마취에 대한 우리의 마지막 선택은 pentobarbital되었습니다. 또한, 마취제와 xylazine은 주로 신장으로 배설됩니다. 신 및 국소 빈혈은 마취제 마취을 연장 수 있습니다.
- 일단 고통이 반사가 다 없어졌어 (핀셋으로 발가락을 쥐어하여 테스트) 생쥐는 왼쪽 측면 decubitus 위치에 (RT, Effenberg, 뮌헨, 독일 37.0 ° C에서 체온을 유지하기 위해) 온도 제어 난방 장치 테이블에 배치됩니다.
- 테이프를 사용하여 테이블에 아래와 상부 사지을 첨부합니다.
- 같은 비디오 데모와 같이 비 생존 수술은 피부를 절단하여 마우스를 머리의 흡입을 방지하고 따라서 마우스 머리 알레르기의 위험을 방지하기 위해 미네랄 오일과 절개 영역을 커버. 생존 실험의 경우에는 머리의 클리핑, iodophors (예 : Betadine), autoclaved 악기 살균 처리와 의사에 대한 마스크를 사용하면 멸균 장갑과 함께 피부의 소독을 포함한 적절한 무균 기술이 필요합니다. 미네랄 오일은 생존의 수술에 사용되지 않습니다. 생존 수술에 대한 살균 NaCl이 사용됩니다
- 오른쪽 측면 절개는 근육과 피부 혈관의 출혈을 방지하기 위해 가위와 응고 전극 (에르베, ICC50, 독일)를 수행합니다. 정중선 개복술을 통해 신장에 액세스와는 달리,이 기법은 복막 캐비티에 대한 액세스를 필요로하지 않습니다.
- 신장 동맥 및 신장 정맥을 포함하여 신장 작은 꽃자루는 4 / 0 실크 봉합사와 오른쪽 신장은 부신 혈관 방해없이 가위로 잘라됩니다를 사용하여 출혈도 잡았 있습니다.
- 수술 상처는 4 / 0 봉합사로 근육 벽 및 피부의 연속 봉합 (두 바늘)를 사용하여 닫힙니다.
- 동물은 다음 오른쪽 측면 decubitus 위치에 배치하고 좌측 절개가 수행됩니다.
- 왼쪽 신장은 조심스럽게 부신과 혈관 피하 결합 조직에서 제거됩니다.
- 다음, 신장은 lucite 컵에 아래의 복부 측면과 함께 켜집니다. lucite 컵은 생존 수술에 대한 소독을해야합니다. 신장의 기둥은 신중하게 포셉와 주변 조직을 개최하여 lucite 컵으로 밀고있다. 이후 막대가 조심스럽게 포셉으로 lucite 컵으로 밀고있다. 신장은 37.0에서 물로 젖었 젖은 면봉 ° C.와 젖은 따뜻한 계속됩니다
- lucite 컵로 왼쪽 신장과 배치의 노출에 따라 신장 홀더는 신장 혈관에 긴장감을 가지고 ventrally 구속됩니다. 충분한 금지는 신장 동맥에서 봉합의 성공적인 배치를 위해 중요합니다. 이후 신장 홀더가 고정이며 신장 정맥 위에 실행으로 신장 동맥은 쉽게 확인할 수 있습니다.
- 신장 동맥은 가까이는 이륙 미세 집게와 복부 대동맥부터, 인접 조직에서 해부하는 것입니다. 동맥은 매우 상단에 굽은 집게로 기본 정맥의 해부합니다.
- 8 / 0 실크 봉합사는 (Ethicon, Norderstedt, 독일)을 사용하여 신장 동맥 아래에 배치됩니다최고의 가이드로 하나 포셉. 신장 작은 꽃자루의 클램핑에 비해이 기술은 신장 혈관의 압축을하지 않고 신장에만 동맥 혈류의 중단을 허용합니다.
- 봉합사는 작은 막대기 (준비된 안전 핀 수 있음) 약의 무게 이상 배치됩니다. 1g은 (eppendorf 튜브) 각 엔드에 첨부되어 있습니다. 무게는 밖으로 데리고 또는 eppendorf 튜브에 물을 추가하여 신장 크기에 적용할 수 있습니다. 아무 혈액이 동맥을 통해하지만 동맥에 대한 주요 스트레칭없이 실행되지 않도록하지만, 동맥 약간, 위쪽으로 뽑아해야합니다. 동맥에 대한 주요 스트레치 스트레스는 동맥 벽 및 감소 reperfusion의 두껍게와 혈관 벽에 손상을 일으킬 수 있습니다.
- 가중치가 지원되지 않는하는 동안, 신장 동맥은 즉시 occluded됩니다. 대조적으로, 가중치가 지원되면, 혈액의 흐름이 즉시 장기로 복원됩니다. 성공적인 폐색은 빨간색에서 흰색으로 색상의 변화에 의해 확인됩니다.
- 실험에서 요구하는 등 다양한 국소 빈혈 시간은 수행할 수 있습니다. 전체 reperfusion는 국소 빈혈 시간의 길이에 따라 장소를 취할 것입니다. 45 분까지 국소 빈혈 시간 최대는 복구할 신장 부상을 허용합니다. 우리의 실험 설정에서 우리는 우리가 개선뿐만 아니라 마우스 변형 및 치료에 따라 신장 손상의 장애를 볼 수 있도록하는 중간 신장 부상 국소 빈혈 30 분 ~ 20까지를 사용합니다.
- 완료 reperfusion 후 신장은 lucite 컵 밖으로 교체할 수 있습니다. 따라서 신장 홀더 (Holder)는 수정되지 않은되고 신장에 긴장이 해제됩니다. 두개골 막대가 부드럽게 블랜드 포셉와 컵 밖으로 제거하고 꼬리 극 즉시 다음과 같습니다.
- 마우스의 고정은 (테이프) 공개 수 있으며 마우스 예 : FITC - 이눌린 표시 허가에 대한 나태한 위치에 삽입할 수 있습니다.
- 실험의 하위 집합에서 혈압과 심장 박동을 수술을 통해 녹음하실 수 있습니다. 혈압 측정은 경동맥 동맥 카테터를 통해 지속적으로 얻을 수 있습니다. 간단히, 경동맥은 paratracheal 근육의 무딘 절개를 통해 노출됩니다. 추가 노출 및 조직 외상 (vagal 신경의 특정)의주의 회피 후, 카테터 두 봉합과 작은 클램프를 사용하여 그릇에 삽입됩니다. 혈압은 스타탐 요소 (WK 280, WKK, Kaltbrunn, 스위스)와 측정됩니다.
- FITC - 표시 이눌린 통관을위한 카테 테르는 나트륨 염화물 및 FITC - 라벨 이눌린의 주입을 위해 왼쪽 경정맥 정맥에 삽입되어야합니다. 또한 방광 카테터 상세 설명은 다음과 같은 시간 종속 방식으로 소변 수집 삽입되어야합니다.
2. 신장 손상의 측정
- 일반적으로 다음 결과 매개 변수는 신장 국소 빈혈 다음과 신장 손상을 결정하는 권장합니다 :
사구체 여과 속도 (GFR)을 평가하는 FITC - 표시 이눌린의 허가를 수행합니다. 대안 신장 부상을 다음과 신진 대사 케이지 조사 24시간 통해 크레아티닌 클리어런스 및 혈청 크레아티닌을 결정으로. 신장 H & E의 얼룩과 신장 국소 빈혈 다음과 같은 신장 손상과 염증 24 시간 확인하기 myeloperoxidase (MPO) 엘리사를 수행합니다. - 대사 케이지 조사 :
- 국소 빈혈 다음 왼쪽 신장은 retroperitoneal 위치로 다시 설정되어하고 위에 설명된대로 상처가 닫힙니다.
- 수술의 끝에 마우스는 0.3 ML 정상적인 생리 IP를 수신하고 가열 램프 아래에 2 시간 동안 복구할 수 있습니다.
- 이후 생쥐는 24 시간의 2 배에 대한 신장 기능 매개 변수 결정을위한 신진 대사 케이지 (Tecniplast 독일, Hohenpeissenberg, 독일)에 배치됩니다.
- 각 마우스의 물 섭취가 다시 전체 병을 무게로 24 시간 후에 마우스를 공급하기 전에 물을 빈과 가득한 병을 무게로하여보다 결정되어야한다. 마우스 무게는 잘 결정되어야한다.
- 24 시간 후에 약 75μl 혈액이 짧은 isoflorane의 마취 하에서 모세관을 통해 눈 뒤에 정맥 신경 얼기에서 가져옵니다.
- 신장 기능은 제조 업체`의 프로토콜 (LT - SYS, 노동 + Technik, 베를린, 독일)에 따라 상용 colorimtric 방법을 사용하여 신장 국소 빈혈 후 플라즈마와 소변 크레아티닌 24 시간 측정에 의해 평가됩니다. 플라즈마와 나 +, K의 소변 농도가 + 불꽃 - 방출 광도계 (ELEX 6361, Eppendorf AG, 함부르크, 독일)로 결정됩니다. 신장 배설과 hemodynamic 값은 표준 공식 15-17을 사용하여 계산됩니다.
- 이눌린 등급 : FITC - 이눌린 통관 실험은 신장 국소 빈혈 다음을 수행합니다.
- 왼쪽 경정맥 정맥은 지속적인 전에 대한 cannulated입니다nfusion. 준비 가위 (뒤몽, WPI) 장소 정맥 통해 두 봉합 (4 / 0)와 인접 조직의 정맥을 해부 후. 혈액 흐름을 막을 수있는 proximale 봉합하기 전에 정맥에 클램프 놓으십시오. 이후 말초 매듭을 닫고 말초 봉합 중 하나에 무게를 배치하는 것은 정맥에 긴장을 부담하는 끝납니다. 이것은 정맥에 카테터를하는 것은 매우 중요합니다. 혈관에 작은 오프닝을 절단하는 마이크로 가위를 사용합니다. 훌륭한 포셉 (뒤몽, WPI)와 개방을 보유하고 혈관에 카테터를 놓습니다. 카테 테르는 클램프를 벗을 사전. 당신이 그것을 들고없이 아래로 배치할 수 있도록 카테터에 아무런 긴장감이 없다는 것을 확인하십시오. 그 후 정맥 및 카테 테르를 통해 두 번째 근위 치료를 닫습니다.
- 카테 테르는 일정 시간 소변 수집 방광에 저장됩니다. 따라서 당신은 방광을 통해 피부에 짧은 절개 잘라. 조심스럽게 피부 구멍을 통해 방광을 제거합니다. 젖은 티슈로 방광을 수정. 방광 (4 / 0)를 통해 준비 치료를 놓습니다.
- 쉽게 방광에 문제를 해결하기 위해 만드는 카테터 주위에 반지를 얻으려면 끝에 짧은 카테터의 조각 (1.5cm)와 열 컷.
- 는 매우 상단에있는 방광에 구멍을 잘라 버릴거야. 출혈을 막기 위해 혈관 사이의 상처를 확인하십시오. 방광에 카테터의 큰 끝을 삽입하고 카테터와 방광을 통해 치료를 닫습니다.
- 모든 마우스는 몸무게의 20 %와 동일한 금액의 0.85 %의 나트륨 염화물 솔루션의 볼러스를 받게됩니다. 지속적인 주입은 체중을 800ul/h/25g 및 FITC - 이눌린가 전체 신장 사구체 여과 속도 (GFR)의 평가를 위해 주입에 추가의 속도로 유지됩니다. 20 분 대한 동물의 안정화 후, 20 분 초과 소변 컬렉션은 요도 유량 및 FITC - 이눌린 결정에 대한 (4 회) 수행됩니다. 혈액 FITC - 이눌린의 측정을위한 모든 기간의 중간에 얻을 수 있습니다.
- 20 분 회수 기간이 타이머를 사용하여 시작할 때. 작은 eppendorf 튜브에 방광 카테터의 끝에 배치하여 소변을 수집합니다. 당신이 소변 금액을 확인할 수 있도록 전에 소변 회수 후 튜브 무게를 측정합니다. 혈액 샘플은 각각의 수령 기간의 중간에 모세관 튜브를 통해 retroorbital 혈액 수집 양식 정맥 신경 얼기를 통해 이동합니다.
- 혈액과 신장이 더 이상 분석 예 : MPO 엘리사, 시토킨 EISA, 조직학 각 절차 후 수령하실 수 있습니다.
3. 대표 결과 :
그림 1 신장 국소 빈혈에 걸려 - 무게 시스템의 모델 :. 걸려 체중 시스템이 왼쪽 신장의 신장 국소 빈혈을 유발하기 위해 설립되었습니다. 따라서 8.0 나일론 봉합사는 신장 동맥 아래에 배치했고 각 치료의 끝 부분에 작은 중량 (1g)을 첨부했습니다. 이것은 실험 디자인은 체중 부하를 적용하고 공개하여 신장 동맥의 폐색 가역 수 있습니다.
토론
요약, 현재의 연구는 신장 동맥 폐색에 매달려 - 무게 시스템을 사용 murine 모델의 신장 국소 빈혈을 수행하기위한 새로운 기술을 설명합니다. 사실,이 연구는 따라서 신장 작은 꽃자루의 클램핑과 관련된 다양성을 최소화, 높은 재현성 부상을 보여줍니다.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
현재의 연구는 미국 국립 보건 부여 R01 - HL092188의 기관, R01 - DK083385과 R01HL098294하고, 아나스타샤 교육 연구 재단 (FAER) HKE 부여, JYD 및 DFG (독일 Forschungsgemeinschaft) 연구에 FAER 부여에 의해 지원되었다 AG에 원정대 (GR2121/1-1).
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| Pentobarbital 나트륨 | Vortech 제약 있지, (주) | VPL 9372 | 염분에 4mg/mL |
| 봉합사, 실크 4.0 | 하버드 장치 | 517698 | |
| 봉합사, Prolene 8.0 | Ethicon, 미국 | M8739 | 재사용 |
| 해부 현미경 | Leica | N / A | 관대한 작동 거리를 고려 |
| 난방 장치 테이블 | 알티, Effenberger, 독일 | N / A | 오직 하나의 공급자 |
| 외과 용구 | WPI, 더몬트 | 훌륭한 microvessel의 가위 |
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재인쇄 및 허가
