굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

요약

경쟁 유도 실험 직접 하나의 마우스로 두 개의 서로 다른 세포 인구의 철새 속성을 평가하실 수 있습니다. 여기 우리는 전 생체내 생성 인내심 트로픽 대 비 직감 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 비교하여이 절차를 설명합니다.

초록

발휘하기 위해서는 자신의 기능 lymphocytes은 혈액을두고 신체의 다른 조직으로 마이 그 레이션해야합니다. 내피 세포 및 조직 넘쳐 흐름에 림프구 접착력이 lymphocytes과 내피 세포 ^{1 2에} 표시된 각각의 리간드 (addressins)에 표시 다른 접착 분자에 의해 통제 다단계 프로세스 (유도 수용체)입니다. 이러한 유착 수용체의 기능이 부분적으로 공부를 할 수 있지만 전 생체내 자신의 생리 관련에 대한 궁극적인 시험은 생체내 림프구 접착 및 마이 그 레이션에 동안 자신의 역할을 평가하는 것입니다. intravital 현미경 (IVM)과 유도 실험 : 두 개의 상호 보완적인 전략이 목적을 위해 사용되었습니다. IVM은 실시간으로 가능하고 다른 조직에 유착 폭포 중 특정 유착 수용체의 정확한 기여를 정의하는 필수되어 있지만, IVM은 집중 시간이 소요과 노동, 그것은 종종 정교한 수술 기법의 개발이 필요, 그것은 단일의 사전 격리 필요 세포 인구와 어떤 주어진 시간에 하나의 조직 / 기관의 분석을 수 있습니다. 반대로, 경쟁 유도 실험 같은 마우스의 두 마이 그 레이션 (혹은 이상) 셀 집합에 직접적이고 동시 비교를 허용하지 않으며 그들은 또한 많은 조직과 같은 실험에서 세포의 높은 숫자의 분석을 허용합니다.

여기서 우리는 제어 셀 인구에 비해 같은 특정 조직에 집으로 주어진 세포 유형의 장점 / 단점을 확인하는 데 사용되는 전통적인 경쟁 유도 프로토콜을 설명합니다. 창자 점막이 외부 환경과의 접촉에서 가장 큰 몸 표면이기 때문에 우리는 인내심을 트로픽 대 인내심 트로픽 비 T 세포의 철새 속성을 설명하기 위해 선택하고 또한 최고의 정의 철새 요구 사항을 추가 - 림프 조직이다 . 또한, 최근의 작품은 비타민이 신진 대사 모든 트랜스 retinoic 산 (RA)는 lymphocytes에 창자가 특정 유착 수용체 (인테 a4b7and의 케모카인 수용체 CCR9)를 유도에 대한 책임의 기본 분자 메커니즘 것을 확인했습니다. 따라서, 우리는 쉽게 드디어 여기에서 설명한 경쟁 유도 실험에서 사용할 수있는 각각 RA의 존재 또는 부재의 T 세포를 활성화하여 인내심을 트로픽 및 lymphocytes 인내심 트로픽 비 예 생체내 다수를 생성할 수 있습니다.

프로토콜

인내심을 추적 및 제어 T 세포 1. 전의 생체내 생성 (그림 1 참조)

1. 야생 타입 마우스로부터 비장을 mashing하여 splenocytes를 분리. 5 '400 X G.에 대한 세포의 PBS의 서스펜션과 원심 분리기를 Resuspend 뜨는을 제거 후 2-3 분 동안 ACK 용해 완충액 4 ML에있는 세포 펠렛을 resuspending하여 적혈구를 lyse. 그 후, PBS 5 ML를 추가합니다. 5 '400 XG에 대한 원심 분리기 및 뜨는을 제거하십시오.
2. 1 총 splenocytes을 Resuspend X 10 ⁶ IMDM의 / ML + 10% FBS + 50 MM 2 - 메르 캅 토 에탄올 + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (완료 IMDM). 100-200 NM ³ 최종 농도 RA (또는 Am80 또는 Am580 같은 합성 RAR - agonists)와 보충 하나 중 두 그룹에서 세포를 분리. RA 또는 RAR - agonists의 면전에서 활성화된 T 세포가 a4b7and CCR9을 upregulate하고 RA 않고 활성화된 T 세포가 조절 T 세포가 될 반면, 인내심을 트로픽 T 세포가 될 것입니다.
3. 이전에 반대 인 경우에는 3 번 CD (10 MG / ML) 및 안티 ....

토론

유도 실험 특정 조직에서 전체 세포 인구의 마이 그 레이션하는 것에 대한 매우 귀중한 정보를 제공하더라도, 그것은 이러한 assays 직접 내피 접착력을 분석하지 않으며 따라서 차별하지 않는 마음에 보관되어야하는 다단계 부착의 어느 단계 (S)에 캐스케이드 (tethering / 인증 또는 고집 롤링) 지정된 추적 수용체는 행동이다. 유착 층계에 들어가고 수용체의 특정 역할을 정의하는 황금 표준은 개별 찬란 표시된 T 세포 (또는 다른 셀 또는 찬란 표시 구슬) 직접 실시간으로 내피 세포와 상호 작용 관찰하는 intravital 현미경 (IVM)입니다. 그러나, IVM은 시간이 소요됩니다 마우스 마취가 필요합니다, 힘드는 수술 절차를 의미하고 라벨 및 사출에 대한 순수하고 균질 세포 인구의 다수의 사전 고립이 필요합니다. 또한, 같은 중추 신경계 (CNS)와 thymus 같은 일부 조직은 IVM에 대한 액세스하기 어렵습니다. 마지막으로, IVM 준비는 간, 폐, 대장 같은 일부 기관 / 조직 (IVM에 대한 자세한 논의에 대한.......

재료

동물 : C57BL / 6 마우스는 일반적으로 T 세포 절연을 위해 사용됩니다. 또한, CD45.1 및 Thy1.1 congenic 계통 잭슨 연구소 (바 하버, ME)를 통해 사용할 수 있습니다.

문화 미디어 : IMDM (Iscove의 수정 Dulbecco의 중간 + L - 글루타민 + Hepes) 플러스 10% 열 inactivated 100 U / ML 페니실린과 보충 FBS (태아 소 혈청, 낮은 내독소, Gibco ®, Invitrogen, 칼스 배드, CA), 100 MG / ML 스트렙토 마이신 (항생제의 HyClone, 월섬, MA), 0.5은 MG / ML fungizone / amphotericin B (Gibco), 50 MM B - 메르 캅 토 에탄올.

ACK 적혈구 세포 용해 버퍼 (RBC, 10 MM KHCO _3, 150 MM NH ₄ Club 호텔, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)) 산도 7.2-7.4와 실온에서 저장을 조절할 수 있습니다.

PBS (인산이 살린, Hyclone, 월섬, MA를 버퍼).

유동세포계측법 (외과) 미디어 (PBS 또는 IMDM + 2퍼센트 FBS + 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 이 MM CA와 Selectin - FC chimeras, 미디어를 사용하면 얼룩 ^{+ +} 모든 단계 (외과 인수 포함)에 사용해야합니다. IMDM이 경우에 권장합니다.

T 세포 라벨링 및 입양 전송 : CFSE (carboxyfluorescein 디아 세 테이트, succinimidyl 에스테르), CMTMR - 분자 프로브에서 ((5 (그리고 - 6 )-((( 4 - chloromethyl) 벤조일) 아미노) tetramethylrhodamine) ®, Invitrogen, 칼스 배드, CA ). 1000 X 주식은 DMSO로 작성 (5 MM의 CFSE, 20 MM CMTMR)와 -20 ° C.에 보관해야

Polyclonal T 세포 활성화 : 24 - 글쎄 또는 96 - 웰 플레이트는 (조직 문화 처리, 뚜껑이있는 평면 바닥 폴리스티렌, BD 팔콘, 프랭클린 레이크스, NJ)는 ° C와 50 ML PBS, 각각 37에서 2 시간 동안 incubated 아르 , 안티 인 경우에는 3 번 CD 플러스 안티 CD28 항체 (10 MG / ML 각)이있는. 그런 다음, 문화 플레이트는 PBS로 두 번 씻어하고 T 세포 문화의 즉시 사용됩니다. 또는 anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, 칼스 배드, CA)로 코팅 Dynabeads 대신 판 - 바운드 항체의 T 세포 활성화에 사용할 수 있습니다.

유동세포계측법 (외과) 얼룩 : Polyclonal 인증 : 인 경우에는 3 번 CD (1452C11), CD28 (37.51). 리니지 mAb : CD4 (L3T4), CD8a (LY - 2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). 인내심을 유도 수용체 : 정화 CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, 샌디에고, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype 제어 (IgG2a, K). 피부 유도 수용체 : P - selectin - FC (정화 마우스 P - Selectin - IgG의 융합 단백질, BD Pharmingen, 산호세, CA), E - selectin - FC (재조합 마우스 E-Selectin/Fc 치메라, ​​R & D 시스템, 미네 아 폴리스, MN) 플러스 해당 보조 시약의 염소 F (AB ') 2 안티 인간 IgG R - PE (Invitrogen, 칼스 배드, CA).

모든 트랜스 retinoic 산이 (시그마, 세인트 루이스, MO) 준비 중에 노란색 전구 또는 조명의 간접 소스를 사용하여 절대 에탄올 또는 DMSO에 resuspended 있습니다. -80에서 유리 튜브 안에 저장 aliquots ° C와 항상 빛으로부터 보호. 합성 RAR - agonists : Am80 (와코 화학 물질, 리치몬드, VA).