방법 논문

섬유 단백질을 늘이기 및 측정 소설 중력 포스 분석기의 사용을 보여주는

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DOI:

10.3791/2624

⸱

2011년 3월 19일

 , 
1Department of Biological Sciences, University of North Texas

이 논문에서

요약

이것은 목적, 운영, 그리​​고 소설 중력이 분석기의 결과를 보여주는 대표을 단계별로 안내합니다.

초록

macromolecular 구조의 연구는 분자 메커니즘과 기능의 해설에 중요한되었다. 단백질의 구조 기능의 강제 의존도를 테스트 할 수 제한 여러 가지 있지만, 중요한 bioinstruments가 있습니다. 스케일은 연구자가 같은 핵산, 효소, 그리고 생명 유지 작업을 수행하는 모터 단백질과 같은 분자의 nanomechanical 세계로 피어 수있는 방법을 정확하게에 제한 매개 변수를했습니다. 원자 힘 현미경 (AFM)은 잘 전자 현미경과 동등한 거리 해상도 섬유 단백질의 기본 구조를 결정하기 위해 조정됩니다. 그러나, AFM 강제 연구에서 세력은 일반적으로 단일 분자보다 훨씬 높다 1, 2, 경험을 할 수도 있습니다. 광학 트랩 (OT)는 덫을 구슬 사이의 상대적 거리를 결정하는 매우 좋습니다 그리고 그들은 아주 작은 세력에게 3 가르친다 수 있습니다. 그러나, 그들은 연구에서 분자의 정확한 절대 길이를 얻을 수 없습니다. 분자 시뮬레이션은 실험에 지원 정보를 제공하지만, 같은 큰 분자 크기, 장시간 프레임을 처리 및 기타 지원 증거 2, 4의 부재에서 일부 연구자를 설득하는 능력에 한계가 있습니다.

중력이 분광계 (GFS)은 능력의 고유한 조합을 제공함으로써 조사의 무기고에 중요한 틈새를 채운다. 이 악기 98 % 또는 femtonewton 범위에서 nanonewton 범위보다 정확하게 일반적으로 세력을 생성할 수있다. 거리 측정은 현재 다섯 나노미터 및 광학 트랩과 같은 정밀도로 상대 비드 쌍 분리 거리로 절대 분자 길이를 해결할 수 있습니다. 또한, GFS는 스트레칭이나 강제가 평형 근처 어디 uncoiling을 결정하거나 측정 구조적 변화에 대한 나란히 놓다에 등급 힘을 제공할 수 있습니다. 그것은 생리적 힘 하중이 아래에 이벤트를 uncoiling에 관련된 몇 아미노산 잔류물 결정하는도 가능합니다. 어떤 분석을 선행해야 광범위한 강제 보정이 다른 방법에 달리 GFS는 강제로 교정 5 노 필요하지 않습니다. 다른 방법의 강점을 보완함으로써, GFS는 중요한 단백질 및 기타 macromolecules의 nanomechanics을 이해 격차를 다리 것입니다.

프로토콜

소설 GFS 구성 소개

일반적인 가벼운 현미경, 적도 마운트, 카메라, 컴퓨터 [그림 1] GFS는 여러 필수 구성 요소로 구성되어 있습니다. 샘플을 보유하고 봉인 흐름 셀 챔버 또한 GFS 디자인에 따라 필수입니다. 범위는 공간에서 서로 다른 방향으로 회전 수 있도록 가벼운 현미경은 적도 마운트에 장착합니다. 이 기능은 중력의 정적 벡터가 중력의 힘이 샘플에 piconewton 범위의 힘 하중을 가르친다 수 있도록 샘플 벡터 관련 동적 지향 수 있도록 이용할 수 있습니다. 이 예제의 방향 변화를 기록할 수 있도록 카메라가 빛을 현미경의 안구 렌즈를 대체합니다. 이것은 원시 데이터는 디지털 실제 강제로 거리 측정에 데이터를 해석하기 위해 컴퓨터에 의해 조작됩니다. 밀폐 흐름 챔버는 샘플 손실없이 공간에서 자유의 학위를 허용하도록 설계되었습니다. 챔버에서 챔버의 표면에 붙어있는 "고정"구슬 하나의 종점 근처 곁에있는 샘플 분자가 상주. 반대 종점이 챔버의 표면에서 무료 "모바일"구슬로 곁에 있습니다. 그것은, 따라서 이러한 낮은 강제 부하에 닿는 분자를 스트레칭 중력에 의해시 행동 수있는 분석 버퍼에서 무료로이 모바일 구슬이다 [그림 2]. 그것이 두 구슬의 흐름 챔버의 표면에 앉아있는 쌍에서 분자들의 부착에 의해 결합하여 잘 사용 가능한 쌍을 분별 몇 가지 경험을 걸립니까하지만 예제는 단순히 현미경 microspheres 한 쌍의 같다. 시스템에 하나 수정 GFS를 보유하고 온천에 의해 정지되는 부동 플랫폼의 추가되었습니다. 이 구성에서는 한번 예제 중력은 샘플에 따라 행동 수있는 위치로 회전되어, 플랫폼의 모든 구성 요소는 상수 봄에 대한 떨어뜨린 수 있습니다. 자유 낙하 근처, 모바일 비드에 연기 포스가 제로에 가까운이며, 온천의 최대 확장에서 중력이 두 배만큼 곱한 것입니다. 이러한 방법으로 등급 힘 / 거리 응답은 다른 강제로 부하에 단일 분자의 행동을 측정하기 위해 그래프로 작성할 수 있습니다.

1. Microsphere 준비

  1. 0.04 % 2 분 3 Aminopropyltriethoxysilane (아세톤과 절단)에 유리 또는 실리카 구슬 10 MG에 대한 잠수함.
  2. 이중 증류수 두 가지 변화를 씻어 5 분 2000 XG에서 펠렛을 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오.
  3. 커플링 버퍼 (0.01 M 피리딘 두 번 증류수로 잘라 6.0 산도를 조정) 5 ML을 추가하고, 적극적으로이 혼합물을 지울수가. 위에서 설명한 원심 분리기. 이 단계를 세 번 반복합니다.
  4. 구슬의 서부 유럽 표준시 케이크 (커플링 버퍼 글루 테르 알데히드를 잘라) 5 % 글루 테르 알데히드 솔루션 2 ML를 추가합니다. 노골적인 협상을 흔들어.
  5. 후드 아래, 실온에서 3 시간 동안 비드 / 글루 테르 알데히드 혼합물을 회전.
  6. 상기 원심 분리기 및 뜨는을 대기음.
  7. 적극적으로 그들을 흔들어하여 결합 버퍼 5 ML에있는 구슬을 씻고 뜨는을 원심과 대기음. 이 서너 번 반복합니다.
  8. 구슬로 원하는 항체의 약 15 μL를 추가하고 적극적으로 발라줍니다. 구슬은 16-24시간 위해 회전해야합니다.
  9. 후드 아래, 1 M 글리신 담금질 솔루션 5 ML을 (더블 증류수와 글리신 잘라 7.0 산도를 조정)을 추가합니다. 적극적으로이 혼합물을 흔들어 30 분간 돌린다.
  10. 원심 분리기 및 뜨는을 대기음.
  11. 세척 버퍼 (; 0.1 %의 나트륨 azide, 0.1 % BSA, 0.15 M NaCl, 그리고 0.001 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.01 M 트리스, 산도 7.0) 5 ML을 추가합니다. 적극적으로이 흔들, 원심 분리기 및 뜨는을 대기음. 이 단계 세 추가 번 반복합니다.
  12. 저염 버퍼 (; 0.02 M 이미다졸, 5 MM MgCl 2; 산도 7.0 0.1 M KCl 조정)에 버퍼를 변경합니다. 세 번 반복합니다.

2. Microspheres 샘플 첨부 파일

  1. 준비 구슬의 소량 가지고 그들을 추가 (일괄 사이의 직경에 큰 차이가있다면, 그러나 구슬 각 케이크에서 약 2 μL를 그것은 작은 구슬에 대규모의 8시 1분 비율 주위에 사용하는 유리합니다) 분석 버퍼와 microcentrifuge 관. 분석 완충액을 사용하여 5 μm의 주위에 단백질의 농도를 줄일 수 있습니다. 버퍼, 단백질, 그리고 구슬을 포함하여 400 μL 이상의 총 볼륨을 준비합니다.
  2. (단백질이 너무 흥분있다면, 그것이 집계를하고 쓸모가) 3 시간 동안 1 시경 RPM에서이 혼합물을 회전합니다.

3. 슬라이드 회의소 준​​비

  1. 0.01 % nitrocellulose (아밀 아세테이트)와 두꺼운 현미경 슬라이드 문장. 약 10 분 동안이 슬라이드 건조하자.
  2. 날카로운 유리 커터와 챔버를 만들기 위해 않도록 슬라이드 커버 절단. 이것은 유리 네 가지 스트립이 필요합니다.
  3. 사실을 사용하여가장자리의 양쪽에 진공 그리스의 얼룩에 걸쳐 유리와 갈퀴 그것의 오리 가장자리.
  4. 마른 nitrocellulose에 보도 기름 코팅 스트립은 슬라이드의 표면에 상자를 만들 수 슬라이드 있었다.
  5. 상자 안에 유리의 표면에 pipetter을 감청하여 비드 / 단백질 혼합물의 피펫 약 2 μL.
  6. 챔버 얼마나 많은에 따라 낮은 소금 버퍼의 20-400 μL에 대한 추가합니다.
  7. 이미 봉인 및 버퍼링 챔버를 완료하기 위해 진공 그리스로 코팅되어 상자의 상단에 커버 슬립을 누르십시오.
  8. 구슬이 nitrocellulose에 자신을 고정하기 위해 충분한 시간을 가지고 있으므로 슬라이드 수준의 장소에 앉아 보자.

4. GFS 데이터 수집

  1. GFS 무대에 마운트 슬라이드
  2. GFS의 카메라가 작은 microsphere가 큰 microsphere의 적도 근처에 첨부되어있는 "비드 쌍"녹음하고 합법적인 검색이란 무엇입니까 모니터.
  3. 잠재적인 구슬 페어가 발견되면, "모바일"구슬이 슬라이드의 표면에 휴식하지 않은 경우 결정하는 초점의 깊이를 통해 이동합니다.
  4. 일단 적당한 쌍 식별, 참고 각도 모바일 구슬 D 맥스 거리 (D = 최대 결합 microspheres의 centroids 사이의 최대 거리). 비디오를 얻기위한 위치로 범위를 이동합니다.
  5. GFS의 여행의 각도가 D 분, D 맥스와 분자의 길이에 따라 25-90 정도 부를 수도 D 분을 기록하기에 충분해야합니다.
  6. 쌍 같은 기록은 D에서 D 최대 분으로, 그리고 다시 D 분으로 여행.
  7. 그것이 분석을 위해 나중에 빼서 수 있도록 또한 배경의 영화를 촬영하는 것이 좋습니다.
  8. GFS 드롭을 수행하는 경우, D 최대로 범위를 이동하고 초당 최소 60 프레임에서 드롭을 기록합니다. 중요한 부분은 첫 번째 진동이지만, 긴 기록 시간도 역동적인 연구에 사용할 수 있습니다.

5. GFS 데이터 분석

  1. 디지털 "thresholded"원시 이미지로 비디오를 변환 및 비디오의 모든 프레임에 각 비드의 중심 위치를 결정하기 위해 imageJ에서 매크로를 실행합니다. 이것은 드롭 동영상도 있습니다.
  2. X, Y 및 Excel로 ImageJ에서 영역 데이터를 덤프하여 포인트를 플롯.
  3. 적절한 구슬 쌍 동영상에 인수되었다하면, 그래프에 눈에 고비 (D 분) 자신의 가장 가까운에서되는 비즈 지표이며 그래프의 정점에서 D 최대의 위치입니다.
  4. 이 데이터를 사용하여 각 비드의 반경은 정확히 ImageJ 결정되어야하며 모든 정보는 중첩된 방정식으로 들어가게된다 :
    D = [(G 죄악 α) 2 + (g 왜냐하면 α + D 맥스 - G) 2] 0.5
    g = [D 분 2 + R B 2 - (R + R B) 2] 0.5 = R B 속죄 β
    C = D 맥스 - R A - G
    (D centroids 사이의 거리 =; g = 중력의 힘, α = 객관적인 렌즈로 평행도의 각도, R B 모바일 비드의 = 반경, R = 반지름의 정박 비드;의 축에서 첨부 파일의 β = 각도 고정 비드의 적도.
  5. 또한 볼륨을 산출하고, 비드의 밀도, 모바일 비드가 분자에 부여 힘을​​ 주어 이동 비드의 장착 반경을 사용하는 것은 빼서있는 용매의 부력 이후 piconewtons으로 계산하실 수 있습니다. 이 방법은 piconewtons에 닿는 분자에 힘을 측정합니다. F = V (DB) (F = 힘, V = 부피, D 유리 microsphere의 = 밀도, A = 가속 나노미터에서 항체 첨부 파일 사이의 절대 분자 길이를 계산 중력으로 인해, B = 갑작스런 물의 밀도).

6. 대표 결과 :

비드 준비가 올바르게 수행하는 경우도 간혹 구슬 덩어리가있을 수 있지만, 최소 비드 집계있을 것입니다. 스코프를 통해서 볼 때, 챔버의 이점 여부 구슬의 합리적인 분배가 있어야합니다.

최대한 진동을 최소화하는 것이 중요하다,이 중 공기 테이블을 수행하는 특수 충격 EQ 마운트를 보유하고 삼각대를 위해 다리를 흡수하거나, 스프링이 진동 절연을 위해 사용할 수있는 활용 시스템에.

봉인 흐름 챔버에 관한 또 다른 유용한 팁은 완전히 구축 후 그것이 수준의 테이블에서 약 5 분 참을 수 있도록하는 것입니다. 이것은 무소속의 큰 구슬은 nitrocellulose의 계층에서 버퍼와 나머지를 통해 천천히 내려갈 수 있습니다. 슬라이드 대신이 완료되면 직접 장착면, 수사관 계속 그대로보기의 필드를 통해 비행 구슬 처리 할 것입니다, 그리고이 동영상을 수집하는 동안 무슨 일이 생기면 그것은 일을 손상시킬 수E 실험. 이것이 정상적으로 완료되면, 비드 항공편이 크게 최소화하고 깨끗한 동영상 검색 결과입니다.

잠재적인 구슬 쌍 GFS 연산자에 의해 확인되면, 그것은 쌍 동작을 모니터링하는 예비 순환을 통해 그것을 넣어 유용합니다. 거의, 큰 비드가 단단히 슬라이드에 부착된 없다. 이 발생하면 그것이 더 큰이 인수 기간을 통해 고정된 위치에 비드 체류를 고정하는 것이 중요하기 때문에, 그 쌍을 이용에 사용가 없습니다. 분과는 현재 안정적으로 동작하고 있으며 전시하지 않는 경우 "고정 비드 롤을"다음은 실험에 적합합니다.

중력에 상대적 각도 변화 비교 비드 분리 거리의 플롯은 획득한 데이터를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 좋은 대표 결과는 고원에서 약간 분리를 보여와 모바일 비드 때문에 중력의 영향 정박 비드에서 자신을 해제 한, 그래프는 더 많은 분리가 표시됩니다. 좋은 피크가 D 최대라고하는 도달하고 곡선 다시 기본으로 돌아간다 아래 시작 때까지이 지속적으로 D 분 [그림 1]. 이상적인 조건에서이 서명이 대칭이다. 비 관계자 결과는 뚜렷한 D 분 - D 맥스 - D 분 패턴을 보이지 조리 패턴으로 그래프를 보여, 아니면 사이에 먼지 조각이있다 아마 나타내는 단일 분자에 비해 너무 크기의 명령 분판을 보여 모바일 비드가 단순히 전혀 첨부되지 않았음을 아마 비즈 또는. , 그 쌍을 찾는 그것을 촬영, 그것을 처리하고 분석하는 과정은 부적 절한 구슬 쌍이 밖으로 학살 많은 정지 격차가 있습니다. 그래서, 당신은 전체 프로세스의 마지막에 도착하고 이전 결과와 일치하는 분자의 길이있다면, 하나는 원래의 구슬 쌍의가 대표하고 결과에 포함시킬 수있는 매우 확신할 수 있습니다. 좋은 하루에서 비드 쌍 주사의 약 절반이 합법적인 데이터 포인트가 될 통해 이동하실 수 있습니다. 예를 들어, MF20 MF30과 항체 사이의 마이 오신의 코일 코일의 길이는 EM 데이터와 AFM, 100 nm의 2,7,8,9에 접근하기 위해 데이터를 기반으로 알려져 있습니다. 그 결과이 길이가 여러 번있는 경우 예제는 집계했다. 여기 제시 결과는 표준 GFS 순환 실험에서 있으며, 96 nm의의 거리 ± 5 NM을 발휘, [그림 2] MF30의 측정과 긴밀히 동의 (마이 오신 subfragment - 2의 N - 말단에 바인딩) 및 MF20하는 문학 값에서 유추 마이 오신에 (빛의 meromyosin에 바인딩하는) 항체 분리 거리 [그림 3].

그림 1
그림 1. GFS 구성. GFS의 주요 부분이 표시됩니다.

그림 2
그림 2. GFS 원리의 도식. 왼쪽 고정 비즈의 중심에서 최소 거리에서 모바일 비드의 중심 보여줍니다. GFS는 회전이기 때문에, 모바일 비드도 곁에 분자의 축과 평행하게 실행되고 중력의 벡터로 정렬. 이 위치에서 모바일 및 고정 구슬의 centroids 사이의 거리가 최대입니다. 오른쪽 상단은 GFS 영화에서 대표 슬라이스를 보여줍니다. 오른쪽 하단은 GFS받은 회전의 이미지입니다.

그림 3
그림 3 그래프의 왼쪽에 D의 분을 보여주는 대표적인 결과를,. 17.78 미크론의 상대적인 분리에 D 최대 및 구슬 사이의 상대적 분리 17.75에 대한 미크론의 기준 주위 d 개의 분에 대한 반환합니다.

그림 4
그림 4. 평균 MF20 MF30 항체와 96 나노미터 사이의 거리를 보여주는 GFS 순환 실험 결과 대표. 이것은 S2의 대략적인 길이를 나타냅니다.

그림 5
그림 5. 마이 오신 II 이합체은 항체 및 / 또는 굴지의 첨부 파일을 포함 GFS와 함께 사용 가능한 첨부 파일을 표시하는 데 사용됩니다. 다른 GFS 전략 서로 다른 영역을 측정하거나, 마이 오신의 이합체의 막대 도메인에 병렬 강제 직각을 적용하거나하는 다른 부착 가능성이 있습니다.

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토론

디지털 thresholded 표현에 동영상을 변환하면 비디오의 각 프레임에서 동일한 영역을 유지하기 위해 thresholded 이미지 중요합니다. 비즈 페어에 비즈가 독립적으로 서로의 이동 때문에 thresholded 영역에 드리프트는 또한 구슬의 centroids 사이의 상대적 거리가 상당한 오류가 표류하고 소개가 발생할 수 있습니다. 임계값 영역을 제어하는​​ 것은 아래 5 nm의 26 nm의에서 거리 측정에 5 배는 오류를 감소. 또한 거리와 강제로 값을 모두 산출 최종 계산하는 것이 중요합니다 구슬 사이의 비율로 모두 구슬에 대한 정확한 반경 측정을 얻기 위해 매우 중요합니다.

시스템은 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다. 가장 최근의 시스템은 지속적인 온천에 대한 전체 GFS를 놓아 닿는 분자 등급 힘을 부여. 스프링 상수가 결정되면 3 인칭 비디오 현미경 비디오가 촬영되고 두가 함께 서로 연관 동시에 얻을 수 있습니다. 그것은 3 인칭, 서로 연관 영화에서 삭제...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 자료는 부여 번호 0842736 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원하는 작업을 기반으로합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-아미노프로필트리에톡시실란Polysciences, Inc.919-30-2
아세톤Fisher ScientificA18P-4
피리딘Sigma-Aldrich110-86-1
글루타르알데하이드Fisher ScientificG7776
글리신Research OrganicsBP381-1
트리스(Tris)Sigma-Aldrich9682T
아지드화 나트륨Amresco71289
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichAMR-0332-100G
NaClSigma-AldrichS7653
EDTA질량 분석 이미징E9884
니트로셀룰로오스Sigma-Aldrich60443
N,N-디메틸포름아미드Large New에서 추출됨D4254
토끼 골격근 myosin II뉴질랜드 화이트 토끼 (7-8마리)제공된 원문 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.
MF30 항체 (9-10)발생학 연구 하이브리도마 뱅크MF30
MF20 항체 (6)하이브리도마 뱅크MF20
실험실 현미경북방의WW57905M00
적도식 가대CelestronCG-5
디지털 비디오 카메라Sony CorporationXCDV60
캘리퍼 해제CabelasIA-415482
압축 스프링Jones Spring Co.723
인장 스프링Jones Spring Co.770
ImageJ미국 국립보건원해당 사항 없음
Fire-i 드라이버 &응용 분야 유니브레인(Unibrain)3.80
엑셀Microsoft제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.

참고문헌

  1. Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure. Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).
  2. Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin. Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).
  3. Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers. Nature. 377, 251-254 (1995).
  4. Gawalapu, R. K., Root, D. D. Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft. Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).
  5. Kellermayer, M. S. Z. Visualizing and manipulating individual protein. Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).
  6. Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin. J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).
  7. Godfrey, J. E., Harrington, W. F. Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment. Biochemistry. 9, 886-893 (1970).
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  9. Xu, J., Root, D. D. Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface. Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).
  10. Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy. Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).

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