Method Article

인간 신경 줄기 세포를 Passaging

DOI:

10.3791/263

⸱

August 22nd, 2007

 , 
1Department of Pathology, University of California, Irvine (UCI)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사하고 인간의 신경 발달을 탐험하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간의 줄기 세포 연구의 증가 재현성의 희망에 culturing 및 passaging hNSPCs의 방법을 보여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사할뿐만 아니라 인간의 신경 발달과 병리 많은 근본적인 과정을 탐구하는 수단을 제공합니다. 이 프로토콜은이 기술을 표준화하고 인간의 줄기 세포 연구의 재현성을 증가 기대에 culturing 및 passaging hNSPCs의 간단한 방법을 제공합니다. 우리가 사용하는 hNSPCs은 국립 인간 신경 줄기 세포 자원에 의해 시체 같은 출생 후의 두뇌 cortices으로부터 격리 및 flasks에 점착 성의 문화가 fibronectin (팔머 외, 2001..; 슈워츠 외, 2003)와 코팅으로 성장했다. DMEM에 우리 문화는 우리 hNSPCs : F12 혈청이없는 미디어 EGF, FGF 및 PDGF와 함께 보충 및 통로들을 1시 2분 약 매 칠일. 이러한 조건을 사용하여 문화의 세포의 대부분은 바이폴라 형태를 유지하고 undifferentiated 신경 줄기 세포 (예 : nestin 및 sox2 등)의 마커를 표현한다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고 : 일주일에 한번씩 우리 hNSPCs의 일상 culturing 들어, 우리가 매일하고 일반적으로 통로를 1시 2분 미디어 50-100%을 변경합니다. F12 기지 미디어 : 문화 미디어는 20 %의 비트 9500 DMEM에 1X 항생제 / antimycotic 및 성장 요인을 (EGF, FGF 및 PDGF 40 NG / ML 각)이 포함되어 있습니다.

코팅 휴대용 술병을 준비하고 세포를 Dissociating

  1. 37 10 μg / 야간 4 시간 또는 EMEM에 ML 인간 fibronectin과 passaged 세포, 코트 T25 flasks, ° C 조직 문화의 인큐베이터에 대한 새로운 flasks를 준비합니다. 오른쪽 세포를 passaging 전에 fibronectin 솔루션을 제거하고 PBS로 flasks을 씻어.
  2. 새로운 fibronectin - 코팅 flasks (각 플라스크에 대한 미디어의 절반 최종 볼륨이 "시설"미디어된다는 등)에 passaged 수 세포에서 오래된 "시설"미디어를 전송합니다. 이러한 culturing 조건들은 undifferentiated 상태에서 이러한 세포를 유지 도움이됩니다.
  3. 일단 미디어의 모든 passaged 수 세포에서 제거, P....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는이 프로토콜 hNSPCs의 신뢰할 수있는 문화를 제공하는 것으로 나타났습니다. 우리의 세포에 대한 하나의 중요한 요소들은 상당히 밀도 문화로 보관하고 세포가 스파스되는 시점 passaged 수 없습니다 필요합니다. 우리 손에, 스파스 문화는 매우 느리게 성장 또는 완전히 분열 중지. 문화가 매우 밀도 때 이러한 이유로, 우리는 보통 우리 문화 1시 2분 또는 1시 3분 분할. 그것이 좋은 세포 부착 및 마이 그 레이션을 촉진하지만, laminin 달리, 그것은 또한 세포를 분리하기 위해 셀 분리 버퍼 (CDB)의 사용을 허용 이후 fibronectin과 문화 요리의 코팅 표면은 중요합니다. laminin에 세포 부착이 너무 강해이며 세포 분리를위한 proteolytic 효소 (예 : 트립신)의 사용이 필요합니다. 비 효소 CDB는 세포 표면 단백질의 proteolytic 절단은 시간이 지남에 따라 hNSPCs의 형태학의 변화로 이어질 수 있기 때문에 트립신을 선호합니다. 또한, 에어컨 미디어 culturing의 hNSCPs들은 undifferentiated .......

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 기꺼이 어린이 병원, 그들의 culturing에 hNSPCs과 초기 교육을 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠 인정합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BIT-9500 (BSA, 인슐린, 트랜스페린)시약줄기세포기술09500
항생제-항진균제시약인비트로겐15240-062
DMEM:F12 (1X)시약인비트로겐11330-032
EMEM (1X)시약Mediatech, Inc.표시된카탈로그 #
Fetal Bovine SerumReagentInvitrogen10437-028
FGF, human basic recombinantReagentPeproTech Inc100-18B
PDGF-ABReagentPeproTech Inc100-00AB
EGF, human recombinantReagentBD BiosciencesCB40052표시된 카탈로그 #
Cell Culture Flask, 25 cm2ToolCorning10-126-28Fisher에 의해 배포된 카탈로그 #
Fibronectin, human, natural시약BD BiosciencesCB40008A표시된 카탈로그 아래 Fisher에 의해 배포된 카탈로그 #
Human Neural Stem/Precursor CellsCellsNational Human Neural Stem Cell Resource
세포 해리 완충액시약Invitrogen13150-016

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
  2. Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A ....

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Human Neural Stem CellsCell PassagingFibronectin CoatingCell Dissociation BufferSerum Free MediaT25 Flask CultureCentrifugation ResuspensionImmunofluorescence StainingTransfection ProtocolCell Counting

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