Bimolecular 형광 Complementation

Summary

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Abstract

신호 단지의 subcellular 배포를 정의하면 해당 복잡한에서 출력을 이해하는 데 필수적입니다. 같은 immunoprecipitation과 같은 기존의 방법은 단지의 공간적 지방화에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 반대로, BiFC는 상호 작용과 단백질 단지의 subcellular compartmentalization을 모니터링합니다. 이 방법에서는 fluororescent 단백질 그 다음으로 흥미가있는 두 개의 단백질에 융합 아르 아미노 및 카르복시 - 터미널이 아닌 형광등 조각으로 분할합니다. 형광단의 reconstitution (그림 1) ^1,2에있는 단백질 결과의 상호 작용. BiFC의 제한은 조각난 형광단가 재구성되면 복잡한 ³ 되돌릴 수있다는 것입니다. 이러한 제한은 일시적인 또는 약한 상호 작용을 검출에 유리하지만, 복잡한 역학의 운동 분석하는 걸로. 추가 주의해야 할 점은 재구성 flourophore 다시 실시간으로 상호 작용 ^4의 관찰을 precluding, 성숙하고 형광을 30 분 필요합니다. 단백질 상호 작용 ^5,6 : BiFC는 녹색 형광 단백질 변형으로 기자 단백질 (BiFC), dihydrofolate 환원 효소, B - lactamase, 그리고 단백질을 측정 루시페라제 고용 단백질 조각의 complementation 분석 (PCA)의 구체적인 예입니다. 단백질 연구에 다른 방법 : 세포의 단백질 상호 작용 형광 공동 현지화 및 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) ^7을 포함합니다. 공동 지방화를위한 두 개의 단백질이 개별적으로 직접 형광단 또는 간접 immunofluorescence을 통해 태그가 있습니다. 그러나,이 방법은 어려운 공동 현지화 데이터를 해석할 수 있도록 아닌 상호 작용하는 단백질의 높은 배경에 이르게한다. 또한, 공촛점 현미경의 해상도의 한계로 인해 두 단백질은 반드시 상호 작용없이 공동화된 나타날 수 있습니다. 관심의 두 단백질이 상호 작용하면 BiFC으로 형광은 관찰됩니다. 안달은 단백질 연구를위한 또 다른 우수한 방법이다 : 단백질 상호 작용을하지만, 기술적으로 도전하실 수 있습니다. 안달 실험은 기증자와 수용체가 세포에서 유사한 밝기와 stoichiometry 것으로합니다. 또한, 하나는 수용체의 채널과 반대로 기증자의를 통해 출혈을 차지합니다. 걱정과는 달리, BiFC는 이미지 데이터의 작은 배경 형광, 작은 후처리가 높은 overexpression을 필요로하지 않으며, 약하거나 과도 상호 작용을 감지할 수 있습니다. Bioluminescence의 공명 에너지 전달 (브렛)은 기증자가이를 흥미로운 수용체 발광 생물이 될 수있는 기판을 catalyzes 효소 (예 : 루시페라제)입니다 제외하고 걱정 비슷한 방법입니다. 브레트 통해 출혈의 기술적인 문제와 높은 배경 형광이 부족하지만, 인해 특정 구획 ⁸ 기판 지방화의 부족으로 공간 정보를 제공하는 능력이 부족. 전체 BiFC는들에게만 신호에 대한 통찰력을 얻기 위해 단백질 단지의 subcellular 지방화를 시각화를위한 훌륭한 방법입니다.

Protocol

A. BiFC 보정

1. 형광단을 선택합니다. BiFC 퓨전 파트너 (표 1)으로 잘 작동 등 YFP과 금성 등 여러 fluorophores가있다. 비너스의 아미노 및 카르복시 - 터미널 엔드 YFP BiFC 조각이 형광단 형성 ² 촉진하기 위해 30 ° C에서 미리 배양을 요구하면서, 37 ° C에서 복잡한를 형성 할 수 있습니다. 낮은 온도에서이 부화 일부 세포 프로세스를 변경할 수 있으며, 조각을 선택할 때 고려되어야합니다. 단백질의 카르복시 - 말단에 융합 비너스의 벡터 Addgene (에서 구할 수 있습니다 http://www.addgene.org/pgvec1 컨트롤로 사용하기 위해 추가 구성 예와 함께, seepBiFC - VN173 및 pBiFC - VC155) pBiFC - bJunVN173 그리고 pBiFC - bFosVC155 ^2. 아미노 터미널 비너스 벡터 (pFLAG - VN173 및 PHA - VC155) 등 추가 벡터는 다음 사이트에서 구할 수 있습니다 ....

Discussion

전체 세포의 단백질 상호 작용과 이들 단지의 subcellular 지방화를 결정 : BiFC 단백질을 시각화를위한 훌륭한 방법입니다. BiFC의 장점은 상호 작용하는 단백질이 형광 것을 있으며, 과도 상호 작용을 안정화하고, 영상 데이터의 후처리가 최소집니다. 이 방법의 두 가지 단점은 형광단 및 형광단 복합의 비가 역성에 대한 성숙 시간입니다. 일부 응용 프로그램에서이 비가 역성은 장점으로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 제정 활성화의 결과로, BiFC 복잡한 그 효소의 효소와 활성을 사용할 수 있습니다. 하나는 그 단백질이 복잡한 모집 무엇 확인할 수 있습니다. 또한, BiFC 단지의 비가 역성이 약하거나 과도 상호 작용의 식별을 허용합니다. 적절한 컨트롤 BiFC 실험의 해석을 위해 중요합니다. 빈 BiFC 벡터는 높은 배경 형광 시약에서 이러한 결과로 컨트롤로 사용할 수 없습니다. 적절한 컨트롤은 두 단백질의 상호 작용을 차단하는 것으로 알려져 관심의 단백질 중 하나에 돌연변를 사용하여 포함됩니다. 관심의 단백.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro	10-013
태아 소 혈청	Cellgro	35-011-CV
유리 바닥 Microwell 접시	Matek	P35G-1.5-14C
6-well 접시	Falcon BD	35-3846
Lipofectamine	Invitrogen	18324020
PBS	Cellgro	21-031-CV
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	P6148
컨포칼 현미경	Carl Zeiss, Inc.	LSM510 메타