Method Article

편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석

DOI:

10.3791/2645

⸱

May 31st, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서는 자세한 microinjection 기술을 사용하여 편광 상피 세포의 작은 GTPases의 overexpression 및 분석에 관련된 절차를.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

혀끝의 도메인이 '무료'표면을 얼굴 basolateral 세포막이 기판과 이웃 세포와 접촉에 화학적 및 기능 뚜렷한 혀끝의과 basolateral 도메인으로 자신의 플라즈마 막 분극 상피 세포. 두 멤브레인 도메인은 확산 장벽을 형성 꽉 분기점에 의해 구분됩니다. 이러한 마딘 - 다비 케이 나인 신장 (MDCK) 세포로 상피 세포가 폴리 카보 네이트 필터에서 높은 밀도의 씨앗을 품고 여러 일 1 2 양식 때 혀끝의 - basolateral 분극은 문화에 성공적으로 recapitulated 수 있습니다. 세포 극성의 구축 및 유지 보수는 그러한 RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 및 Rab13 3 4 5 6 7로 라스의 superfamily의 작은 GTPases의 배열에 의해 규제됩니다. 비활성 GDP - 바운드 상태와 활성 GTP - 바운드 주 사이의 모든 GTPases와 마찬가지로 이들 단백질은 사이클. 뉴클레오 티드 바인딩 지역의 특정 돌연변이 자전거 8 방해. 예를 들어, Rab13T22N는 영구적으로 GDP - 형태로 고정하기 때문에 '부정적인 지배'로 명명됨, Rab13Q67L 더 이상 GTP를 hydrolyze 수없는 반면에 있으므로 '지배 운영중'상태 7 잠겨입니다. 그들의 기능을 분석하는 셀에 GTPases 모두 지배적인 부정과 지배 적극적인 대립 유전자는 일반적으로 내생 단백질 구의 기능을 방해하는 높은 수준에서 표현됩니다. 짧은 시간 금액에 overexpression 높은 수준을 달성하기 우아한 방법은 필터 microinjection 기술을 사용하여 지원에 성장 양극 세포의 핵에 직접 관련 단백질을 인코딩 plasmids을 소개하는 것입니다. 이것은 종종 특히 혀끝의 또는 basolateral 도메인에 정렬됩니다 플라즈마 막 수용체를 인코딩 기자 plasmids의 공동 주사와 결합됩니다. 자주 basolateral 도메인에 정렬화물을 분석하는 데 사용되는화물은 기공을 갖는 구염 바이러스 당단백질 (VSVGts045) 10 이상의 온도에 민감한 allele입니다. 이 단백질은 39 ° C에서 제대로 접을 수 없어 관심의 규제 단백질이 cytosol에서 조립하는 동안 따라서 endoplasmic reticulum (ER)에 유지됩니다. 31 이동 ° C 다음 VSVGts045는 플라즈마 막 11 응급실에 여행을 제대로 접어 떠날 수 있습니다. 이 추적은 일반적으로 청소기 결과를 선도하는 추가의 단백질 합성을 방지하기 위해 cycloheximide의 존재에서 수행됩니다. 여기 상세 basolateral 정렬에 관련된 규제 단백질의 포괄적인 분석을 허용 온도 교대를 포함하여 편광 세포와 후속 incubations에 plasmids를 microinjecting의 절차를 설명합니다.

Protocol

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1. 플라스미드 DNA의 분리

  1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 내독소 무료로 DNA를 준비하는 시그마 - 알드리치 내독소 무료 maxiprep 키트를 사용하십시오. 그것이 안정적으로 DNA의 준비로부터 endotoxins를 제거하기 때문에이 키트는 우리를 위해 작동합니다. 세포 핵에 DNA을 주사 Endotoxins는 세포 죽음을 초래합니다.
  2. 분리된 DNA, 소용돌이 및 Eppendorf의 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 1 분 스핀 100 μl 페놀 / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1)을 추가합니다. 새로운 튜브로 상부 급수 단계를 전송 100 μl 클로로포름 / isoamylalcohol (24:1), 위와 같이 소용돌이와 스핀을 추가합니다. 새로운 튜브로 DNA를 포함하는 상부 물 위상을 전송합니다. 이 단계는 microinjection 바늘의 막히는 것을 방지 DNA에서 어떤 단백질을 제거하는 필요합니다.
  3. 300 MM X 2 권 100 % 에탄올의 최종 농도 나 아세테이트 (산도 6.0)을 추가하여 DNA를 침전. 하룻밤 -20 ° C에서 알을 품다. Eppendorf의 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 20 분에 대한 DNA를 스핀, 70 % 에탄올로 한....

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Discussion

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성공 microinjection 실험을위한 가장 중요한 단계는 DNA와 세포의 극성의 품질과 순도 있습니다. 양극 세포없이 사출 제어 이미 VSVG을 mistargeted가되며 실험은 사용할 수 없습니다. DNA는 질이 나쁜 경우, DNA가 가난한 사람들에게 최고의 사출 바늘 또는 모두에 원하는 단백질없이 표현을 방해할 수 있습니다. 또한, 같은 pRKV 같은 높은 표현 수준으로 이어질 것으로 알려진 표현 plasmids를 사용하는 것이 좋습니다입니다.

다른화물 단백질의 분류에 대한 테스트를 원하는 경우, 온도 변화 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 밀도 지단 백질 수용체를 표현하기 위해, 우리는 37 microinjection을 수행 ° 37 1 H 보육 다음 C ° C, 20 4 H ° C (TGN에서화물을 체포하기 위해) 37 2 H ° 0.1 MG / ML cycloheximide의 존재에 C는 표면에 단백질을 추적합니다. 이러한 FC 수용체 같은 단백.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 H. Fölsch에 건강 (GM070736)의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다. SF 앙은 A * STAR 대학원 장학금 수상에 의해 지원되었고, RS 캉은 질병 교육 프로그램의 세포 및 분자 기초 (GM8061)에 의해 지원되었다

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
온수 단계 200 현미경 Axiovert 칼 자이스 혈구 부동산 맞춤 주문
Injectman NI2 Femtojet의 micromanipulator Eppendorf 맞춤 주문
Femtotips II (Microinjection의 바늘) Eppendorf 930000043
Microloader 팁 Eppendorf 930001007
클리어 12 - mm 트랜 스웰 필터 지원 코닝 코스타 3460
내독소없는 플라스미드 maxiprep 키트 시그마 - 알드리치 NA0400

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
  2. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
  3. Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
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  5. Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
  6. Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).....

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Small GTPasesMicroinjection TechniquePolarized Epithelial CellsMDCK CellsPlasmid OverexpressionTemperature Shift AssayCycloheximide TreatmentConfocal MicroscopyBasolateral SortingVSVG Reporter

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