운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

1. 동물 준비

1. pentobarbital 나트륨 (50mg/kg IP) 및 난방 패드에 장소와 쥐 마취. 동물 가위로 사후 두개골을 overlying 피부를 면도. 발가락이 palpebral 반사의 부재로 모근뿐만 아니라 경우 마취 수준의 수술 수준이 탈퇴 반사와 발성의 부재에 대한 테스트에서 얻은되었음을 보증하기 위해 동물을 확인합니다. 마취 15 분 간격의 수준을 확인하고 나트륨 pentobarbital 15mg/kg의 주사 45 분마다에 의해 anesthetisa의 수술 수준을 유지합니다.
2. 무균 기술을 사용하고 복부와 허벅지 안쪽에 의해 형성 포복 절도에 사타구니 지역에서 절개 단지 말초하고 대퇴 정맥에 정맥 (1mm 직경, 클레이 아담스)과 대퇴 동맥에 삽입합니다. 턱밑 지역의 정중선 절개를 만들고, infrahyoid 근육을 반영합니다. 기관의 작은 절개를하고 환기를 허용하도록 정맥 (2mm 직경)를 삽입합니다. 동맥 정맥을 통해 place.Monitor 체계 diastolic 및 수축기 혈압에 확보 cannual trachael 주위에 치료를 타이. 철수와 palpebral 반응을 모니터링하는 것 외에도 지금 마취의 수준을 평가하기 위해 혈압을 모니터링합니다. 정맥 정맥을 통해 필요할 때 추가적인 마취를 관리할 수 있습니다.
3. stereotaxic 프레임에 쥐 장소와 소뇌를 폭로 craniotomy을 수행합니다. 쥐 때문에 환기에 tracheal 정맥을 연결합니다. humidified 공기와 100/min의 속도 2cm ^3의 부피와 동물을 환기. 1cm H ₂ O의 긍정적인 최종 날숨 압력이 폐 붕괴를 방지하기 위해 유지되어야합니다. 매 15 분 무기폐을 방지하기 위해 폐가 hyperinflate. 다음 예열 미네랄 오일 (30 ° C)와 함께 두뇌의 표면을 커버. 직접 두정 골과 interparietal 뼈 사이의 교차점 아래에있는 큰 정맥 구멍을 피하기 위해주의하십시오.
4. 전자기 진동에 결합 막대에 cyanoacrylate 접착제를 적용하고 턱뼈의 치극이라고에있는 막대를 부착합니다. 중 A / D 컴퓨터 출력 또는 신호 발생기의 진동에 mandible 사용하는 명령 신호를 이동합니다.
5. craniotomy에 인접한 피부 아래 siliver - 실버 염화물 접지 전극을 배치합니다.

2. 전극 준비

1. 수평 microelectrode의 풀러를 사용하여 석영 또는 aluminosilicate 유리의 microelectrodes를 조작.
2. 0.25M KCl과 0.5M 트리스 버퍼 HCL (산도 7.6) 또는 호수에서 2 % tetramethlyrhodamine (산도 6)에 녹아있는 5-10%의 biotinamide로 microelectrode를 입력합니다. 전극 시험기와 전극 임피던스를 확인합니다. 대구경 axons에서 기록하려면 60 - 80M Ω의 임피던스와 전극을 작은 axons과 interneurons 80 - 150MΩ의 임피던스와 전극을하십시오.
3. 전위계의 머리 단계에 microelectrode를 놓습니다. 동물의 머리 뒤에 위치에 고정되는 작은 망원경 (동봉 십자선과 함께 20X)을 통해 전극을 시각화. 이 전극은 stereotaxically 큰 정밀도로 위치를 수 있기 때문에 망원경을 사용하는 것이 중요합니다.

3. Electrophysiological 기록 및 세포 염색법

1. 피아 메이터의 작은 오프닝을 만들고 전극은 머리를 닿을 때 피드백 신호가 생산되도록 커패시턴스 피드백을 받으려는. 이것은 두뇌의 표면의 정확한 위치를 수 있습니다.
2. 반복 mandibular 변위를 생산 및 스테핑 모터의 두뇌에 전극 사전.
3. DC 가능성에 갑자기 방울로의 연​​결을 impalements을 인식하고 지속적인 시냅스 활동에 의해 intrasomatic의 연결 impalements를 확인합니다. 커패시턴스의 overcompensation으로 전극을 윙윙하거나 거의 성공적인 세포 침투를 생산하지 도청. 때문에 전극의 높은 임피던스의의 연결 반응이 거의 침투하기 전에 관찰되지 않습니다.
4. 당신이 신경을 찌르려고하고 침투가 안정 것으로 간주되면 램프 길게 및 사인 턱 운동을 사용하여의 연결 반응을 특징 ^5.지도 신경 세포의 수용 필드를 비 전도성 프로브로 머리 주위 피부와 내부 구강을 탐색하여 나무 막대기 등. 연구에 관련된 경우, 그러한 근육 수축 및 유해 자극과 같은 다른 기능 관련 자극에 신경 세포의 반응을 조사 ^6. 프라이 머리 도입 성의 nociceptive의 연결 수용체가 nociceptive 자극에 반응. 같은 pentobarbital 나트륨과 같은 일반적인 anesthesetics은 기본 수입 성의 뉴런에서 axonal 전도를 차단하는 것이 아니라 신경 전송을 우울하게하지 않습니다. 따라서 기본 수입 성의 축삭의 연결에 axonal 전도는 보존됩니다.
5. 15 70nA 분 총 주입 시간 (DC, 1 4nA) 전류 주입. 현재 분사하는 동안 전극 침투를 모니터링하고 막 잠재력이 - 30mV보다 긍정 될 경우에는 중단.

4. 조직 처리

1. (0.9 % NaCl 38 헹굼 혈관과 pentobarbital의 과다 복용 (140mg/kg IV)와 perfuse하여 동물을 안락사 ° C 헤파린 500 단위 및 1ml 2 % 포함하는 0.1M 인산 버퍼에 4 % paraformaldehyde (산도 7.4) 다음 xylocaine .
2. 중 전두엽, 화살이나 수평면에 vibratome를 사용하여 50 100μm의 두뇌와 섹션을 제거합니다. Secions 25 ° C PBS에 부유를 수집하고 있습니다.
3. 1-2% 정상 염소 혈청의 잠복기, 1 % 트리톤 0.01M PBS에 X - 100 아비딘 비오틴 단지에 부화 (1시 50분 엘리트 Vectastain) 다음으로 DAB를위한 두뇌를 처리합니다. H ₂ O _2와 니켈 - DAB를 사용하여 섹션을 반응. 텍사스 레드, 4 박 PBS에 아비딘 - 비오틴 복합 (1시 50분)에 품어 섹션 ° C 후 4 ° C 하룻밤에 PBST에 4% 텍사스 레드 아비딘 DCS에서 품어.위한 처리 23 ° C.에 형광 Nissl 얼룩 (NeuroTrace) 20 분들과 섹션 Counterstain
4. 신경 세포는 rhodamine로 주입 있었다면, 형광 현미경 (예 545nm)로 직접 주입 신경 세포를 시각화.

5. 역행 라벨, immunocytochemistry, 공촛점 이미징, 정량 colocalization 분석 방법을 결합

다른 방법이 기술을 결합의 성공은 좋은 상표 세포에 따라 크게 달라집니다.

1. 방법은 쉽게 역행의 연결 라벨과 함께 조합하여 사용할 수 있습니다 여기에 시각. 이렇게하려면 ^70-10, 동물을 마취 및 무균 기술을 사용하여 이러한 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (20 % 양고추냉이 퍼옥시데이즈. 시그마 VI, 시그마)으로의 연결을 추적기 삽입, 1 % 밀가루 - 세균은 턱 근육과 같은 말초 대상 지역으로 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (시그마)를 aggultinated. 이것의 연결을 추적은 주변 axons로 최대 촬영 및 motoneuron의 somata에 axonal 수송을 통해 운반됩니다. 턱 근육 들어, 추적의 15μl는 살균 10 microliter의 microsyringe를 사용하여 근육에 주입합니다. 마취에서 회복 후 복구를 위해 자신의 새장에 배치까지 동물은 다음 가열 패드에 위치하고 모니터할 수 있습니다. 24 시간 후, 동물 마취 및 생리학 신경을 특징 및 intracellularly 그들을 얼룩. 다음 코발트와 안정기 및 심화로 chromagen 나트륨 tungstate로 tetramethylbenzidine (TMB)를 사용 HRP의 존재에 대한 이상 및 프로세스 조직 섹션에서 설명하는 것처럼 동물을 perfuse. 1 %의 나트륨에 넣어 섹션은 0.1M PBS (산도 6.5)와 15 절대 에탄올과 아세톤에 용해 0.0007 %의 TMB에 녹아있는 tungstate ° C 20 분. 그렇다면 0.3 % 60 분 부화 솔루션 100ml 당 H ₂ O ₂ 1.0 ML를 추가하여 조직 섹션을 반응. 0.05 %의 diaminobenzidine (산도 7.4), 0.02 %의 코발트와 0.01 % H ₂ 10 분 0.1M PBS (산도 7.4)에서 O ₂ 0.1M PBS (산도 6.5)에 조직과 장소를 씻어. 37 ° C. 설명한대로 biotinamide로 주입 신경 세포의 시각화를위한 조직을 처리하고 표시된 감각 뉴런과 motoneurons 다양한 사이의 관계를 시각화.
2. 여기에 표시된 기술도 쉽게 immnocytochemistry와 함께하실 수 있습니다. ⁶ 예를 들어, immunocytochemically 정확하게 표시 뉴런 사이 시냅스 (그림 3) 찾을 수 synaptophysin에 대한 두뇌를 처리합니다. 이렇게하려면 4 이일 ° C 그리고 23 1H에 대한 안티 마우스 FITC (1:400)에서 품어 ° C.에 대한 마우스 방지 synaptophysin 항체 (1:10,000)에서 뇌 부분을 품어
3. 형광 마커로 표시하거나 형광 이미징을위한 처리 뉴런은 공촛점 이미징에 이상적입니다. 그림 3은 축삭의 부통 통해 공촛점 현미경과 취득 광학 섹션의 예입니다. (그림 3). 라벨 신경 세포 (그림 4)를 통해 여러 광학 부분을 인수하여 분류 뉴런의 애니메이션을 생성할 수 있습니다.
4. 이 방법으로 표시 뉴런은 양적 colocalization 분석에 사용할 수 있습니다. 이렇게하려면 (http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm에서 확인) NIH 이미지와 함께 공개 소프트웨어 매크로를 사용합니다. synaptophysin의 immunocytochemistry와 세포내 상표를 결합하여 단일 축삭 터미널 내에서 synaptophysin을 집중하다 ^6.

6. 대표 결과 :

이 방법을 사용하여 얻을 수있는 대표적인 결과의 개요는 그림 1에서 그림입니다. 이것은 하나의 brainstem 신경이 electrophysiologically 분명히 볼 수 있듯이, mandible 운동 기간 동안 기록되었다,이 신경 세포의 반응 (그림 1 왼쪽, 하늘색 하단)은 운동 중에 변조되었습니다. 이 신경 세포는 electrophysiological 특성 후 biotinamide와 함께 주입하고 이후 시각화에 대한 처리되었습니다. 재건축 신경 세포 (그림 1 중간, 녹색)가 실제 수해부 획기적인 테드,이 경우에는 삼차 모터 핵은 (빨간색 테두리) 지정. 움직임과 재건축 기간 동안의 연결에 따라 응답이 신경 세포는 보조 근육 스핀들 수입 성의 신경 세포로 확인할 수 있습니다. 그림 2 조 변위 동안 신경 세포의 생리적 반응의 대표적인 예를 보여줍니다. 신경 세포의 반응은 즉각적인 발사 주파수로 표현된다. 의 연결 응답이 밀접하게이 특정 신경 세포가 mandibular 위치에 관한 감각 피드백을 제공 나타내는 mandibular 변위를 모방 것을. 그림 3 참고 synaptophysin에 대한 얼룩과 Nissl은 얼룩과 함께 intracellularly 스테인드 축삭의 높은 배율 이미지입니다. 축삭 부통 이내 synaptophysin (노란색)의 colocalization을 확인합니다. 그림 4는 단일 생리학 특징 및 intracellularly 레이블 신경 세포의 애니메이션입니다.

그림 1. 방법의 개요. 왼쪽 상단 : mandibular 변위. 하나의 신경 (노란색)에서 중간 세포 녹화 (녹색). 이 신경 세포의 형태는 세포 기록하고 주사 후 복원되었다. 레드 개요 삼차 모터 핵의 위치를​​ 나타냅니다. 왼쪽 하단 : 턱 운동 중에이 신경 세포의 생리 반응합니다.

그림 2. mandible 운동하는 동안 생체내에 기록된 하나의 근육 감각 신경 세포의 생리 반응 대표. 턱 변위로의 연결 응답의 유사성을 확인합니다.

그림 3. 탐색 근육 동안 응답 intracellularly 묻은 감각 신경 세포의 시냅스 부튼스 (적색 swellings)와 터미널 axonal arborization. synaptophysin에 대한 후속 immunocytochemical 처리 axonal 부통 (노란색) 이내 synaptophysin의 지방화를 보여줍니다. 녹색 형광 Nissl가 얼룩이다.

그림 4. 생리 반응 mandibular 운동 중에 생체내에 기록된 근육 스핀들 주 수입 성의 신경 세포의 축삭의 애니메이션은 축삭은 다음 intracellularly 스테인드 및 가시화를위한 처리되었습니다.
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여기에 그림 4의 중간 해상도 비디오를 다운로드