트립토판 형광으로 막 단백질 폴딩의 깁스 자유 에너지를 얻기 위해이 동영상 기사 세부 실험 절차.
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이 논문에서
요약
초록
막 단백질 접힘은 기본적인 건강 관련 모두 의미있는 새로운 주제입니다. 세포의 underlies 단백질이 유비 쿼터스 가족의 접는 종합 학습에 대한 필요성의 막 단백질의 풍부. 또한, misfolded 단백질과 관련된 질병의 특징 우리의 방위 능력에 대한 발전은 단백질 폴딩의 분야에서 상당한 실험 및 이론적인 노력을 동기 있습니다. 이 중요한 분야에서 급속한 진전은 불행하게도 막 단백질과 접는 메커니즘의 복잡과 관련된 고유의 도전에 의해 방해합니다. 여기, 우리는 E. 대표 일체형 멤브레인 단백질에 대한, denaturant, Δ G ° H 2 O의 부재에서 펼쳐의 깁스 자유 에너지의 열역학적 특성을 측정하기위한 실험 절차를 설명합니다 대장균. 이 프로토콜은 denaturant 농도의 함수로 접힌 및 펼쳐진 상태의 평형 인구를 결정하기 위해 형광 분광법의 응용 프로그램에 초점을 맞추고 있습니다. 합성 지질 vesicles뿐 아니라 데이터 분석 절차의 주요 단계의 준비를 위해 실험적인 고려 사항이 강조 표시됩니다. 이 기술은 다양한이며 온도와 산도,뿐만 아니라 lipids과 micelles의 다양한 환경을 포함하여 접는 denaturant의 종류와 추구있을 수 있습니다. 현재 프로토콜은 아래에 설명되어 기준 집합을 충족하는 막이나 가용성 단백질에 일반 수있는 하나입니다.
프로토콜
1. 막 단백질 폴딩에 대한 ~ 50 나노미터 직경 소형 Unilamellar Vesicles (포드 SUV)의 준비
- 1,2 - dimyristoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (DMPC) 클로로포름에 lipids의 솔루션은 스토리지를위한 유리병 수량 당 20 밀리그램에서 구입한 깨끗한 유리 튜브에 aliquotted입니다. 질소 가스 층은 지질 산화를 방지하기 위해 각 유리병에 추가하고, 유리병은 뚜껑과 parafilm과 함께 봉인하고 있습니다. 튜브는 사용 전까지 -20 ° C의 냉동고에 저장됩니다.
- 클로로포름 20 MG의 지질의 나누어지는를 포함 하나의 약병은 각 실험에 사용됩니다. 유리병의 내용은없이 용매 남아 때까지 1 시간 동안 질소 가스의 흐름을 사용하여 건조합니다.
- 말린 lipids 20 MM의 칼륨 인산 버퍼 1 ML에 resuspended 아르 ~ 30 초 동안 물 목욕 sonicator를 사용하여 (산도 = 7.3). 정지 지방질의이 솔루션은 흐림 나타납니다, 그리고 원뿔 바닥과 플라스틱 15 ML 튜브로 전송됩니다. 인산염 버퍼의 또 다른 한 ML의 나누어지는 원래 지질을 포함 빈 유리관에 추가하고, sonication이 반복되며 솔루션은 다음 같은 15 ML ....
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토론
현재 프로토콜은 트립토판 잔류물을 포함하는 막 - 관련 단백질과 펩티드의 곡선을 펼쳐의 생성을 설명합니다. 여기, 그것은 트립토판의 형광이 단백질이 접힌 및 합성 지질 vesicles에 삽입하거나, 용액에 펼쳐진 여부를 반영하는 것으로 간주됩니다. 이러한 두 상태 폴딩 및 denaturant 농도와 자유 에너지의 선형 의존성과 같은 추가 가정은, 현재의 보고서에서 만들어집니다,. 다른 방정식에서 이러한 가정의 결과의 수정 2 실험 프로토콜은 쉽게 다른 spectroscopic observables을 활용하는 수정할 수 있습니다, 이러한 원형 dichroism, 흡수, 또는 불순물 염료의 형광 3뿐만 아니라 겔 전기 영동으로 4. 또한, 같은 음이온 lipids 같은 guanidinium, 산성 솔루션, 또는 온도뿐만 아니라 대체 lipids / vesicles와 같은 다른 denaturants,, 대형 unilamellar vesicles, 또는 micelles는 마지.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 그녀의 데이터를 사용하기 위해 베이징 우 감사합니다. 이 작품은 JEK에 NSF 경력 보너스에 의해 지원되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| 요소 | MP Biomedicals | 04821527 | |
| 인산수소칼륨 | Fisher Scientific | P288 | |
| 인산이수소칼륨 | Fisher Scientific | P285 |
참고문헌
- Shirley, B. A. Protein Folding and Stability. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U.
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