방법 논문

Immunocytochemistry : 인간 신경 줄기 세포

DOI:

10.3791/267

⸱

2007년 8월 24일

 , 
1Department of Pathology, University of California, Irvine (UCI)

이 논문에서

요약

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Immunocytochemistry은 존재, subcellular 지방화 및 교양 세포에 대한 관심의 항원의 상대적인 풍부를 결정하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 선물 쉬운 따라 하나가 항체를 절약 하나의 얼룩을 최대한 활용 수있게 단계 시리즈.

초록

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Immunocytochemistry은 존재를 결정하는 매우 강력하고 매우 간단 방법, subcellular 지방화, 그리고 가장 일반적으로 흥미, 교양 세포에있는 단백질의 항원의 상대적인 풍부합니다. 이 프로토콜은 선물 쉬운 따라 자신의 얼룩 밖으로 고품질 재현할 질적 및 양적 데이터를 가져오는 동안 연구자 기본 및 보조 항체를 보존하기 위해 사용됩니다 단계 시리즈. 얼룩에 필요한 항체의 볼륨을 보존하는 데 도움이 프로토콜의 두 측면이 있습니다. 하나의 세포는 조직 문화 판의 우물에 배치됩니다 작은 원형 coverslips에 성장하고 있습니다. 고정 후 coverslips에있는 세포는 접시의 우물에서 제거할 수 있습니다. 항체 얼룩 경우, 세포와 coverslip은 parafilm에 대한 항체 솔루션의 작은 방울로 반전하고 건조 방지하기 위해 parafilm의 두 번째 조각으로 덮여있다. 이 방법을 사용하여 항체 솔루션만이 ~ 25 μl가 물들다 각 coverslip (또는 샘플) 필요합니다. 이 프로토콜은 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)의 immunostaining 설명하지만, 많은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

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1 일 : 독일어 유리 Coverslips 준비 및 심는 세포

참고 : 독일어 유리 coverslips 자주 culturing 주요 신경 줄기 세포 뉴런에 바람직합니다. 우리는 세포 접착 및 확산을 개선하기 위해 다음과 같은 청소 프로토콜을 사용합니다. coverslip 양쪽에 액체 액세스를 허용하는 작은 랙에 위치 coverslips. 첫째, 10 분 1 % Liquinox에서 품어의 coverslips는 탈이온수 3 씻는다 다음. 어떤 비누 거품이 남아도는지 확인합니다. 다음, 30 분 1M HCL에 품어 전표는 탈이온수 3 씻는다 다음. 65 드라이 coverslips ° C 하룻밤. 유리 접시와 소독을 압력솥에 coverslips을 전송.

  1. 조직 문화 후드에서 적절하게 크기 잘 플레이트에 살균 coverslips를 배치합니다.

  2. 세포 유착에 대한 laminin과 외투 coverslips. 10 μg / 실온에서 5 분간 살균 물에 ML 폴리 D - 라이신 (PDL)의 부화의 coverslips. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 하루 4 시간 또는 EMEM 20 μg / ML의 laminin의 PDL과 부화 coverslips를 제거합니다.

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토론

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이 프로토콜은 필요한 항체의 볼륨을 최소화하고 안정적​​인 세포 얼룩을 제공 hNSPCs위한 immunostaining 절차를 설명합니다. 설명된 절차는 세포내 항원 최선이지만, 세포 표면 분자를 얼룩이나 cytoskeleton의 얼룩을 향상시키기 위해 수정할 수 있습니다.

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감사의 글

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저자는 어린이 병원 parafilm의 얼룩 기술의 초기 교육에 대해 에모리 대학에서 hNSPC 문화와 박사 게리 Bassell를 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠을 인정하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
독일 유리(Deutsche Spiegelglas) 커버슬립도구Carolina BiologicalWW-63-302912,15,18, 22, 25mm 커버슬립 사용 가능
리퀴녹스 인산염이 없는 세제시약Sigma-AldrichZ273279점성이 매우 높은
Poly-D-lysine 하이드로브로마이드시약Sigma-AldrichP7280
라미닌, 천연 마우스시약Invitrogen23017-015
EMEM (1X)시약Mediatech, Inc.MT-10-010-CV표시된 카탈로그 #
24 웰 플레이트ToolFisher Scientific08-772-1
Triton X-100시약Fisher ScientificBP151-500매우 점성이 높은
파라포름알데히드시약Sigma-AldrichP6148잠재적 발암 물질, 분말 및 용액 형태로
사용할 때 주의하십시오.소 혈청 알부민, IgG-free시약Jackson ImmunoResearch001-000-161
H– chst 33342시약InvitrogenH-1399
Vectashield시약벡터 실험실H-1000점성

참고문헌

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  1. Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
  2. Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S.

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