일반적으로 이러한 DNA를 laddering 또는 TUNEL의 assays 같은 포유류의 시스템에서 사용되는 프로그램 세포 사망 assays은 종종 공장에서 재현하기가 어렵습니다. 귀스 기자 제도와 함께, 우리는 특정 유전자의 잠재적인 사형 속성을 분석하는 빠른, 식물 기반의 과도 분석을 제안합니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 동시에 세포 죽음의 putative 긍정적이거나 부정적인 규제와 리포터 유전자, β - glucuronidase (거스)를 표현하는 소설 과도 공장 표현 시스템을 개발했습니다. 이 시스템에서는, N. benthamiana의 잎은 분석하는 유전자를 포함하는 35S 구동 표현 카세트 공동 침투되며, 거스 벡터 pCAMBIA 2301은 차량으로 Agrobacterium 스트레인 LBA4404를 사용합니다. 거스 표현식이 발생하는 라이브 세포가 필요하기 때문에이 마커 유전자가 세포 죽음의 긍정적인 규제와 함께 공동으로 표현 때 거스 활동의 손실이 예상된다. 마찬가지로, 거스 활동 안티 apoptotic 유전자는 벡터 제어에 비해 사용하는 경우 관찰 증가했다. 아래 그림과 같이, 우리는 성공적으로 모두 프로와 안티 죽음 플레이어를 분석하기 위해 실험실에서이 시스템을 사용하고 있습니다. 이들은 같은 백스와 같은 세포 사망의 포유 동물 inducers 알려진 안티 - apoptotic 공장 BCL - 2 관련 athanoGene (BAG) 가족뿐만 아니라를 포함. 또한, 우리는이 단백질의 가능한 포스트 translational 수정 / 정품 인증에 대한 단서를 제공할 수 단백질 내의 특정 truncations의 죽음 기능을 분석하기 위해이 시스템을 사용하고 있습니다. 여기, 우리는 특정 유전자의 죽음 기능을 조사하는 초기 단계로, 신속하고 민감한 식물을 기반으로 방법을 제시한다.
프로토콜
Nicotiana benthamiana 공장은 25 ° C에서 온도 제어 성장 챔버 재배하고 있습니다. 3~6주 오래된 식물의 완전 확장 건강한 단풍이 사용됩니다.
팁 : 더 나은 결과를 새로 신흥 잎을 사용하여 얻을 수 있습니다
1. Agrobacterium 과도 침투 프로토콜 :
1 일
- 세포 죽음에 대한 assayed하는 유전자 (들)과 포함하는 벡터로 적절한 벡터를 포함하는 Agrobacterium tumefaciens (변형 LBA4404)의 글리세롤 주식과 리크 LB / Rifampicin (25 μg / ML) / Kanamycin (100 μg / ML) 한천 플레이트 제정 발기인 아래 거스 카세트. 항상 부정적인 컨트롤로 빈 벡터 제어를 포함합니다.
- 28 ° C 2 일 품어.
3 일
- / Rifampicin / Kanamycin 판은 이전에 줄무늬 각 LB에서 하나의 식민지와 Rifampicin (25 μg / ML)과 Kanamycin (100 μg / ML)를 포함하는 LB 2 ML의 예방. <....
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토론
그것은 포유류의 시스템에서 일반적인 식물의 세포 사망 탐지 기술을 사용하는 것이 어렵습니다. 귀스 기자 제도와 함께, 우리는 세포 죽음 선수의 검출 및 분석을위한 식물을 기반으로, 중요한 방법을 제시한다. 이 방법은 라이브 세포가 발생하는 거스 표현에 필요한 그 단순한 사실을 활용합니다. 의미있는 결과와 repeatability를 보장하기 위해, 그것은 거스 카세트 및 assayed되도록 유전자를 숨겨주는 문화가 동등한 비율로 침투되는 중요합니다. 추가 잠재적인 세포 죽음의 플레이어를 비교할 때 이러한 비율은 유지되어야합니다. 위의 그림과 같이, 우리는 성공적으로 많은 유전자의 잠재적인 사형 기능을 조사하기 위해 우리가 실험실에서이 방법을 사용했습니다. 때문에 단순하게, 우리는이 시스템이 정기적으로 죽음의 모듈 레이터를 감지하는 데 사용할 수 있다고 생각합니다. 또한, 방법은 단일 문화 혼합물에서 여러 유전자를 수용하도록 조정할 수 있습니다. 때로는 사건으로, 특정 유전자의 세포 죽음 기능은 다른 프로그램 세포 사망 ef.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | DMSO의 25mg/mL 주식 |
| 4' - 히드록시 - 3 ', 5' - dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | DMSO에서 0.981 g / ML (1M 주식) |
| 2 - (4 - morpholino) ethanesulfonic의 산성 일수화물 (MES) | VWR | EM - 6110 | 1.92 g / 침투 미디어 1 L를 만들기위한 물에 L |
| Bacto - tryptone | 어부 | BP1421 - 2 | 10g / LB 매체 1 L를 만들기위한 물에 L |
| Bacto - 효모 추출물 | VWR | EM1.03753.0500 | 5g / 물 L LB 매체 1 L을 만들기위한 |
| 나트륨 염화물 | VWR | EM - 7710 | 10g / LB 매체 1 L를 만들기위한 물에 L |
| 인산 나트륨 일염기의 일수화물 | VWR | MK - 7868-12 | 버퍼 NaPi의 50mM 만들기위한 물에 2.5G / L |
| 인산 나트륨 이염의 heptahydrate | VWR | EMD - SX0715 - 1 | 5g / 물 L 버퍼 NaPi의 50mM 만들기위한 |
| 마그네슘 황산의 heptahydrate | VWR | EM - MX0070 - 1 | 2.5 G / 침투 미디어 1 L를 만들기위한 물에 L |
| N - Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151 - 500G | 0.1 % 거스 버퍼에 V / V |
| 5 - 브로모 -4 - 클로로 - 3 - indoxyl - 베타 - D - glucuronide cyclohexylammonium 소금 (X - gluc) | 골드 생명 공학 | G1281C | 메탄올 백퍼센트에 1mg/100uL |
| 4 Methylumbelliferyl - μ - D - glucuronide 하이드 레이트 (얼굴) | 시그마 | M5664 | 거스 추출 버퍼 100 UL 2 MM |
| 칼륨 ferrocyanide trihydrate | VWR | EM - PX1460 - 1 | X - gluc 기판 솔루션 100mM 주식 |
| β - Methylumbelliferone (MU) | 시그마 - 알드리치 | M1381 | MU 표준 곡선을 사용 거스 추출 버퍼 |
| 나트륨 탄산염 | VWR | EM - SX0395 - 11 | 거스 중지 버퍼를 만들기위한 물 0.2 M |
참고문헌
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M.
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