Method Article

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

DOI:

10.3791/270

⸱

August 30th, 2007

 ,  , 
1Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology; Center for Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 세포 캡처 및 문화를 활성화할 수 있습니다 microfluidic 장치의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는 이러한 microfluidic 채널 내에서 홈과 같은 패턴 microstructures는 셀 수있는 부두 내에서 낮은 전단 응력 영역을 작성하는 데 사용됩니다.

Abstract

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우리는 세포 행위를 연구에 대한 microgrooved 패턴과 microfluidic 장치를 설명합니다. 이 microfluidic 플랫폼은 최고의 유체 채널 및 하단 microgrooved 기판으로 구성되어 있습니다. microgrooved 채널을 조작하려면, microfluidic 채널의 인상을 포함하는 최고의 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS) 몰드는 정렬과 microgrooved 기판에 접착했습니다. , 마우스 fibroblast 세포가 (25, 50, 75, 100 μm의 폭) 고정 및 microgrooved 기판 내에 패턴했다이 장치를 사용합니다. microfluidic 장치에서 apoptosis를 공부하려면, 과산화수소, Annexin V 및 propidium 요오드화물의를 포함하는 미디어는 2 시간 동안 유체 채널로 perfused되었습니다. 우리는 산화 스트레스에 노출된 세포가 apoptotic 된 것으로 나타났습니다. 이러한 apoptotic 세포는 apoptosis 과정에서 플라즈마 막의 바깥쪽 전단지에 phosphatidylserine로 바운드되는 Annexin V에 의해 확인되었다. microgrooved 패턴이 microfluidic 장치를 사용하여 apoptosis의 과정은 실시간으로 관찰 및 배양 챔버 (37 ° C, 5 % CO 2)를 포함 거꾸로 현미경을 사용하여 분석되었다. 따라서, microgrooved 기판과 통합이 microfluidic 장치는 세포 행동을 공부하고 높은 처리량 약물 검사를 수행하는 데 유용 수 있습니다.

Protocol

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microfluidic 장치의 A.의 Microfabrication

  1. 4 인치 웨이퍼는시 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)로 처리됩니다.
  2. 부정적인 포토 레지스트 (SU - 8 2015, Microchem, MA)는시 웨이퍼 1 분 900 rpm으로 스핀 - 코팅입니다.
  3. 웨이퍼는 부드럽 95에서 구운 ° C가 열판에 6 분 및 microchannels를 포함하는 마스크 필름을 통해 4 분에 대한 자외선 (200W)에 노출됩니다.
  4. 웨이퍼 95에서 구운 게시물 ° C 6 분 및 SU - 8 포토 레지스트 개발를 사용하여 개발된 것입니다. 것입니다
  5. microchannels를 포함하는 포토 레지스트 패턴 웨이퍼는 페트리 접시에 - 배치됩니다.
  6. 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) 금형은 혼합 실리콘 엘라스토머 및 치료 에이전트 (10시 1분 비율)에 의해 가공됩니다.
  7. PDMS 혼합물은시 마스터 몰드에 붓고하고 거품을 제거하는 진공 건조기에 배치됩니다.
  8. PDMS는 1 ~ 2 시간 동안 70 ° C에서 치료됩니다.
  9. PDMS 금형은 다음시 마스터 금형으로부터 떨어져 벗겨 수 있습니다.

B.이 장치를 조립

  1. 40 μm의 두께가 상단 유체 채널 및 40 μm의 두께 하단 microgrooved 채널 (25, 50, 75, 100 μ m 폭) 두 개의 서로 다른시 마스터 금형으로부터 얻을 수 있습니다.
  2. 유체 장치의 채널 입구와 출구는 펀치입니다.
  3. 유체 채널과 마이크로 그루브 채널 irreversibly 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)에 의해 결합됩니다.
  4. 세포외 매트릭스 (ECM) (즉, fibronectin)는 인큐베이터에서 1 시간 (37 ° C)에 대한 microfluidic 장치 내부에 코팅됩니다.

C. 셀 시딩 및 실험 설정

  1. NIH - 3T3 섬유아 세포는 마우스 10% 태아 소 혈청 (FBS)이 포함된 Dulbecco의 수정된 이글의 미디어 (DMEM)을 사용하여 조직 배양 플라스크에 양식 있습니다.
  2. 세포가 trypsinized 및 dissociated 있습니다.
  3. Dissociated 세포는 3 셀 밀도 × 10 6 세포 / ML (그림 1)에서 마이크로 그루브 채널로로드됩니다.

    figure-protocol-1
    그림 1

  4. 2 ML 미디어, 100 MM H 2 O 2, apoptosis 분석 (20 μL Annexin V 40 μL propidium의 요오드화물, Invitrogen, CA)를 주사기 펌프 (1 μl / 분)을 사용하여 채널에 들어갈 수 있습니다.
  5. 세포는 거꾸로 현미경 (니콘 TE 2000)를 사용하여 모니터링 실시간 있습니다.

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Discussion

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전지 microfluidic 장치에서 고정 및 microgrooved 기판 내에 패턴했다. 과산화수소에 노출 세포의 apoptosis 과정이 실시간으로 관찰 및 Annexin V 및 propidium 요오드화물의를 사용하여 분석되었다. 따라서, 마이크로 그루브 채널을 포함하는이 microfluidic 장치는 높은 처리량 약물 검사에 유용 수 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PDMS시약K.R. 앤더슨 (K.R. Anderson Co.)2065622폴리(디메틸실록산), 다우코닝 실가드 184(8.6lb)
DMEM배지Invitrogen11965Dulbecco' 의 변형된 독수리' s Media
FBS혈청Invitrogen10082-147소 태아 혈청
과산화수소시약Sigma-AldrichH1009
Apoptosis 분석InvitrogenV13242Annexin A, 프로피듐 요오드화물
네거티브 포토레지스트 MicroChem Corp.SU-8 2015
Si 웨이퍼 도구4 인치 실리콘 웨이퍼
반응성 산소 플라즈마 시약Harrick Scientific Products, Inc.30W 도립 현미경에서 웨이퍼 5분 처리
도구Nikon InstrumentsTE 2000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
  2. Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
  3. Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).

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Microfluidic DeviceMicrogrooved SubstratePDMS MoldPlasma TreatmentCell PatterningApoptosis AnalysisAnnexin V StainingHydrogen Peroxide TreatmentInverted MicroscopyFlow Induction

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