우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
주변 신경계 (PNS)에 그가 부상 후 제한된 범위 (탱 외., 2006)으로 재생을하는 동안 중추 신경계 (CNS)에 Axons이 재생되지 않습니다. 이것은 neurite 및 axonal 가지 필수 transcriptional 프로그램 PNS (Makwana 외., 2005)의 부상에 따라 활성화되는 인식됩니다. 그러나 생체내로의 연결을 유전자 규제를 분석에 사용할 수있는 도구가 제한되어 종종 도전하고 있습니다.
CNS와 PNS 모두 같은 소마에서 발생하는 bifurcated 축삭에 의해 innervated 때문에 지느러미 루트 신경 (DRG)는 훌륭한 상해 모델 시스템을 제공합니다. 신경은 모든 transcriptional 이벤트가 발생 세포 기관의 이산 컬렉션을 대표하고, 따라서 쉽게 reproducibly 동물에서 제거할 수 있습니다 transcriptional 활동의 명확하게 정의된 영역을 제공합니다. axonal 중생이 발생 PNS (예 : 좌골 신경)에서 신경 섬유의 부상은 재생이 장소 (예 : 척수을하지 않습니다 어디 CNS에서 비슷한 부상에 대응 사람에서 구분되는 transcriptional 프로그램의 집합을 공개합니다 ). 히스톤, 바인딩 전사 인자와 부상에서 PNS 또는 CNS 중 하나에 발생 DNA 조작을위한 사이트는 염색질 immunoprecipitation을 (칩)을 사용하여 특징하실 수 있습니다.
여기, 우리는 axonal 부상을 다음과 고정 마우스 DRG 조직을 사용하여 칩 프로토콜을 설명합니다. 이 강력한 결합은 axonal 재생을 촉진하는 데 필요한 프로 재생 염색질 환경을 특성화를위한 수단을 제공합니다.
프로토콜
1. 좌골 & 지느러미 열 신경 손상
- 동물은 수술 수건에 위치하고 아래 thermopad 37에서 마우스의 체온을 유지 ° C. 절차 전반에 걸쳐 존재입니다 모든 동물은 지속적인 O / isoflurane이 관리와 수술 anesthetized 있습니다. 외과 용구는 절차 전에 autoclaved 있습니다.
- 좌골 신경통의 부상, 두 엉덩이쪽에 신중하게 면도 있으며, 왁스는 사전 Betadyne 3 회 다음 알코올로 피부를 클렌징하는 일반 헤어 제거제와 함께 완료됩니다.
- 좌골 신경은 4mm의 절개가 후부과 피부를 통해 중반 허벅지에있는 대퇴골을 병행함으로써 훌륭한 포셉과 팔뚝의 femoris의 간격 근육을 확산하여 노출됩니다.
- 노출된 좌골 신경이 그 부상하고, 피부가 두 봉합 클립과 함께 닫힙니다.
참고 : 동일한 절개가 좌골 신경을 노출했다지만, 상처가 가짜 부상에 대한 신경은 그대로 둔 폐쇄 봉합합니다.
- 등의 열 손상의 경우 마우스의 뒷면을 세심하게 면도하고, 왁스는 이전에 알코올 스프레이 / 강타와 함께 피부를 클렌징하는 일반 헤어 제거제와 함께 완료됩니다.
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토론
이 프로토콜은 직접 axonal 부상 다음과 같은 성인 신경계의 axonal 중생 중에 염색질 환경에 대해 문의하는 방법을 제공합니다. 그것은 PNS 또는 CNS를 하나에 부상 이후 transcriptional 및 epigenetic 환경을 탐사하기 위해 염색질 immunoprecipitation와 DRG 상해 모델을 포함합니다. 그것은 자신이 좋아하는 전사 인자에 대한 putative 구속력이 사이트를 특성화하고 싶습니다,이 사이트의 수용 인원은 부상에 대한 응답으로 발생 여부를 확인하는 조사에 특히 유용합니다. 해당 사이트에서 histones과 DNA의 Epigenetic 변경도 동시에 모니터링할 수 있습니다. 우리가 이전에 (테데스키 외., 2009)보고와 유사한 프로토콜은 얼굴 신경 핵이 brainstem의 해부와 칩으로 처리할 수 안면 신경 병변, 다음을 수행할 수 있습니다.
염색질의 immunoprecipitation의 assays에 관해서는 전형적.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 미세 조정 칩에 대한 조건에 자신의 기여에 대한 실험과 리코 린드너의 초기 칩 실험 설정에 대한 도움 안드레아 테데스키 감사하고 싶습니다. 이 작품은 Hertie 재단에 의해 지원되었다; 포춘 그랜트, Tuebingen 대학 및 DFG DI 1497/1-1 보조금 (모든 시몬 디 지오 바니 부여).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 10X 칩 버퍼 | 세포 신호 | 7008 | |
| 2X 칩 용출 버퍼 | 세포 신호 | 7009 | |
| 칩 학년 단백질 G 자성 비즈 | 세포 신호 | 9006 | |
| 마그나 그립 랙 (물론 8) | Millipore | 20-400 | |
| 클로로포름 | 머크 | UN 1888 | |
| 37 % 포름 알데히드 | 로스 | CP10.1 | |
| 10X 글리신 솔루션 | 세포 신호 | 7005 | |
| 글리코겐 | 시그마 | G1767 | |
| 10X HBSS | Gibco | 14,185 | |
| 히스톤 H3 항체 (토끼) | 세포 신호 | 2650 | |
| 일반 래빗 IgG | 세포 신호 | 2729 | |
| 페놀 / 클로로포름 / Isoamyl 알코올 | 로스 | A156.1 | |
| 프로 테아제 억제제 칵테일 정제 | 로체 | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 MG / ML) | 세포 신호 | 10,012 | |
| SDS 용해 버퍼 | 북부 | 20-163 |
| 장비 필요 |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
참고문헌
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Har....
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