Method Article

특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법

DOI:

10.3791/2820

⸱

December 3rd, 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Water and Food Viral Pollution, Department of Microbiology, Faculty of Biology, University of Barcelona

In This Article

Summary

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연구는 산악 표준시 도구로 제안 인간 / 돼지의 / 소 DNA 바이러스, adenoviruses과 polyomaviruses의 특정 부량에 대한 qPCR을 사용하여 물속에서 nitrates에 의해 배설물 / 소변 오염 또는 오염의 소스의 식별을위한 비용 효율적인 방법을 설명합니다.

Abstract

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환경의 미생물 오염 중요한 건강 위험을 나타냅니다. 고전 세균 배설물 지표는 상당한 한계를 가지고 나타났습니다, 바이러스 오염의 원인에 대한 정보를 제공하지 않는 많은 불활 ​​성화 과정 및 표준 배설물 지표에 더 저항하고 있습니다. 물 분자 assays에서 바이러스의 농도에 대한 비용 효율적인 방법의 개발은 배설물 오염의 지표와 같은 미생물의 소스 추적 (MST) 도구와 같은 바이러스의 적용을 용이하게합니다. Adenoviruses 및 polyomaviruses 인간을 포함한 척추 특정 수종을 감염 DNA 바이러스이며 지속적으로 배설물 및 / 또는 공부를 모든 분야에서 지역 소변에서 배설됩니다. 이전 연구에서 우리는 인간 adenoviruses (HAdV)과 인간의 배설물로 오염의 인덱스로 정량 PCR (qPCR)에 의해 JC의 polyomaviruses (JCPyV)의 부량을 제안했습니다. 최근, 우리는 포의 특정 부량에 대한 qPCR의 assays을 개발했습니다cine의 adenoviruses (PAdV) 및 테스트 튜브 당 10-10 게놈 사본 감성과 오염의 동물 배설물 마커로 소 polyomaviruses (BPyV). 본 연구에서는, 우리는 이러한 도구를 사용하여 물 샘플의 오염의 원인을 확인하기 위해 따라야하는 절차를 제시한다. 대표 결과 예를 들어, nitrates의 높은 수준을 보여주고 지하수의 바이러스의 분석이 나타납니다.

낮은 또는 적당히 오염된 바다에서 바이러스가 탐지되면 훨씬 작은 볼륨, 보통 시리즈의 두 농도 단계를 포함하는 프로 시저에 물을 적어도 몇 리터에서 바이러스의 농도를 필요로합니다. 이 다소 성가신 과정 및 바이러스 recoveries에서 관찰 다양성은 크게 물 샘플을 다수의 동시 처리를 방해.

우리가 이전 studie에서 개발한 한 단계 프로토콜을 적용 두 단계 절차로 인해 발생하는 병목 현상을 제거하기 위해의 및 수상 매트릭스의 다양한 적용. 열 리터 물 샘플의 산성화, 무지방 우유에 의해 응집, flocculated 물질의 중력 침강, 침전과 원심 분리를 수집, 10 ML 인산 버퍼에있는 침전물의 resuspension를 : 프로 시저가 포함됩니다. 바이러스 집중은 바이러스 핵산과 특정 adenoviruses과 관심 polyomaviruses qPCR에 의한 계량 아르의 추출에 사용됩니다. 샘플 높은 번호는 동시에이 저렴한 비용으로 집중 방법을 사용하여 분석 수 있습니다.

절차는 입욕 물, 해수 및 하천 물의 분석에 적용이 연구에서 우리는 지하수 샘플을 분석 결과를 제시했습니다. 이 높은 처리량 정량 방법, 신뢰할 수있는 간단하고, 비용 효과적입니다.

Protocol

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1. 바이러스 입자의 농도는 물 샘플에 존재

  1. 수집 및 물 샘플의 컨디셔닝
    1. 2의 최소 프로세스 제어와 같은 평면 하단에 하나 추가 샘플과 플라스틱 용기에 시료 당 10 L의 복제 수집합니다. 마지막 예제는 바이러스 입자의 알려진 양의 마약을하고 컨트롤로 사용됩니다.
      참고 :이 아군 샘플 특별한 별도의 자료를 (병, 튜브 등)을 권장합니다.
    2. conductimeter의 교정을 확인하고 필요한 경우 재조정. 한 개는 플라스틱 10 L 컨테이너에서 이전에 충분한 전도성으로 조정 수돗물을 (1.6 아래 참조)를 사용하여 부정적인 컨트롤을 준비합니다.
    3. 아군 샘플 : 샘플로 제어 바이러스의 표준 볼륨 (물 10 L 당 약 10 5 게놈 사본) 추가합니다. 피하 splashing 및 에어로졸에 감동하여 섞는다. 긍정적인 컨트롤은 아데노 바이러스 s의 드문 변형으로 이루어져 수HAdV - 35 또는 MS2 같은 박테리오 파지로 uch.
    4. 샘플 정지 재료 (모래 또는 기타 자료)의 높은 수량을 제시하는 경우 15 분 동안 퇴적물을하자. 새 용기에 물을 전송합니다.
    5. 1 N HCL의 추가에 의해 3.5 (± 0.1)로 물 시료의 산도를 조정합니다. 이 단계는 바이러스의 농도 중요하....

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Discussion

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재현성, 신뢰성, 간단하고 비용 효율 : 설명 절차는 일상적인 환경과 공중 보건 실험실의 피팅 방법에 대한 조건을 충족합니다. 프로토콜은 간단하다, 그러나 그것은 신중하게 따라야합니다. 응집에 대한 교반 시간이 크게 (예를 들어 미만 5 시간) 감소 경우가대로 인공 해수 염분의 요청 농도를 추가하지 않고 샘플의 낮은 전도성이 크게 바이러스의 회복을 줄일 것입니다.

현재 적용 산악 표준시 도구는 일반적으로 분자 기술을 기반으로합니다. 다른 그룹에 의해 개발 연구 필요에 따라 현재 사용 매개 변수 밖으로 (즉, 박테리아 유전자)가 아무도 구체적으로 없다는 것을 보여주었다. 따라서 이러한 매개 변수의 조합의 사용은 물이 기관 8,11의 배설물로 오염의 근원의 효율적인 추적을위한 최적의 근사치로 제안되었습니다.

최근 jove_content ">, 대부분의 경우 임상 증상의 부재로 지속적인 감염을 생산 선택한 DNA 바이러스의 연구 .......

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Disclosures

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두 개의 특허 출원이 PAdV과 BPyV의 부량을위한 프로토콜의 지적 재산권을 보호하기 위해 2009 년 제기했다.

Acknowledgements

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이 작품은 부분적으로 유럽 연합 (EU) 연구 프레임 워크 7 투자 프로젝트 (계약 번호 513648) VIROBATHE, VIROCLIME (계약 번호 243923로, 스페인 정부 "정부의 드 Educación Y Ciencia"(프로젝트 AGL2008-05275-C01/ALI)에 의해 지원되었다 )과 물의 카탈루냐어 기관, Agència Catalana DE L' Aigua (ACA), Departament 드 제어 내가 Millora dels Ecosistemes 수상하여. 개발 연구 기간 동안 마르타 Rusiñol는 카탈루냐어 정부 "AGAUR"(FI - DGR)의 동료했다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
고속 원심 분리기 (8,000 XG) Berckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 아벤티 J - 20XP
산도 미터, 온도계 및 conductimeter Afora LPPC3003
플라스틱 튜브 1백-2백센티미터 길이 Deltalab 350,059
멸균 일회용 pipettes 졸업 Labclinics PN10E1
1.5 10-15 ML (Eppendorf, 팔콘, 등) 살균 플라스틱 튜브 Afora KA298/00
원심 분리기의 냄비 (500 ML) 피셔 과학 SE5753512
자기 stirrers 및 자석 (당샘플) 피셔 과학 10,510
자기 stirrers의 사용을 허용하는 평면 바닥 데 유리 또는 플라스틱 용기 Deltalab 191,642
뜨는 (또는 물 제트 진공 펌프)를 제거 연동 펌프 왓슨 - Marlow 323E / D
타이머 스위치 - 오프 80-10시간 후 감동에 Deltalab 900,400
염산 (1N과 0.1N) Panreac 141020.1611
수산화 나트륨 (1N) Panreac 131687.1211
인공 해수 바다 소금 시그마 S9883
무지방 우유 (SM) Difco 232,100
인산 버퍼 산도 75 1시 2분 V / V 살균 나 2 HPO 4 0,2 M과 산도 7.5에 아니 2 PO 4 0,2 M
Thiosulphate Panreac 121879.1209 물에 10 % 용액을 만들어
QIAamp 바이러스성 RNA 미니 키트 Qiagen 52,904
96 - 웰 광 반응 플레이트 (500 세대) 응용 Biosystems 43426659
광학 접착제 커버 (100 세대) 응용 Biosystems 4,311,971
TaqMan 환경 PCR 마스터 믹스 2 배 응용 Biosystems 4,396,838

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
  2. Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R.

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