생체내에 방법을 설명합니다. Cre 호텔 및 / 또는 형광 단백질을 표현하는 재조합 AAVs는 신생아 마우스 두뇌에 주입하고 있습니다. 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨이 신경 회로 개발에 중요한 공정에서 유전자 기능의 빠른 분석을 허용, 달성하고 있습니다.
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방법 논문
바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석
이 논문에서
요약
초록
신경 회로가 성숙하고 세련된 때 정상 뇌 기능은 출생 후의 개발뿐만 아니라 주요의 연결 경로가 설정됩니다 배아 발달에 의존하지만. 이 단계에서 Misregulation는 자폐증과 정신 분열증의 1,2로 신경 및 정신 장애가 발생할 수 있습니다. 많은 유전자가 태아 뇌에서 공부하고 많은 발달 과정을 3-5으로 중요한 발견되었습니다. 그러나, 출생 후의 두뇌에서 기능은 생쥐에서 삭제가 자주 신생아 개발 중에 파괴 장면을 보여 주죠에 이르게 일부 있기 때문에, 그리고 초기 개발에 자신의 요구 사항이 출생 후의 분석을 초래할 일부 있기 때문에, 대부분 알 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복하려면 유전자의 대립 유전자는 현재 floxed 생쥐 6 생성되고있다. 표현 Cre 호텔 recombinase는 특정 세포 종류에 조건부 삭제는 출생 후의 두뇌에서 유전자 기능을 연구하기 위해 얻을 수있는 유전자 변형 대립 유전자와 결합하는 경우. 그러나,이 방법은이를 마우스 두뇌의 규모에 유전자 분석의 확장을 제한, 추가 대립 유전자 및 여분의 시간 (3-6개월) 적절한 genotypes와 마우스를 생성해야합니다.
여기 우리는 출생 후의 두뇌 개발에 신속하게 그리고 체계적으로 이러한 floxed 대립 유전자 연구를 virally - Cre 호텔 표현을 사용하는 보완 방법을 보여줍니다. 신생아 두뇌에 재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 7,8 인코딩 Cre 호텔을 주입함으로써, 우리는 두뇌의 다른 지역에 대한 관심의 유전자를 삭제할 수 있습니다. 바이러스 titer를 제어 및 형광 단백질 마커를 coexpressing함으로써, 우리는 동시에 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 분기와 기와뿐만 아니라 버렸네 형성 및 개선, 초기 개발에 많은 유전자의 요구를 무시하고, 우리 axonal 및 돌기의 성장을 포함하여 출생 후의 두뇌 개발에 많은 중요한 과정에서 세포 자율 기능을 공부하실 수 있습니다. 이 방법은 우리 자신의 연구실에서 (미발표 결과) 등 8,9에서 성공적으로 사용되었으며, 같은 lentivirus 9뿐만 아니라 shRNA 또는 지배 활성 단백질 10의 표현에 다른 바이러스에 확장될 수 있습니다. 또한, 전기 생리학이 기술을 결합뿐만 아니라 최근에 개발된 광학 이미징 도구 11,이 방법은 유전자 경로가 마우스 및 쥐의 신경 회로 개발과 기능에 영향을 미치는 방법을 연구하기 위해 새로운 전략을 제공합니다.
프로토콜
1. 주사 준비 바이러스
- rAAVs은 권장 상업 공급 업체에서 구입한 있었으나, 그들은 또한 (아래 토론을 참조) 자신의 연구실에서 생산 수 있습니다. 바이러스 솔루션은 일반적으로 밀리리터 당 ~ 1x10 12 게놈 사본 (GC / ML)의 titer에서 생산하고 세포의 큰 숫자를 조작하는 전체 titer에서 사용할 수 있습니다. 또는, 그들은 스파스 라벨의 원하는 수준을 생산하는 희석 수 있습니다. 적절한 희석은 사용자에 의해 결정되어야합니다,하지만 1시 10분 희석을 시작하는 것이 좋습니다.
- 사용하기 전에 즉시 얼음에 바이러스를 녹여. 소형 (~ 250μl) PCR 튜브에 바이러스 솔루션의 원하는 미리 희석 볼륨을 전송합니다. 조직 문화 후드의 살균 DPBS의 적절한 볼륨을 사용하여 바이러스 솔루션을 희석. 그것이 필요 때까지 얼음에 희석 바이러스 솔루션을 저장합니다.
참고 : 모든 바이러스의 처리는 기관의 승인을 biosafety 프로토콜에 따라 실시되어야합니다
2. 주사기 로딩 및 장비 조립
- 부드럽게 플런저를 당기는하여 유리 주사기로 로딩 바늘을 연결하여 PCR 튜브에서 바이러스 솔루션을 그립니....
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토론
여기에 제시 신생아 바이러스성 주입 방법은 출생 후의 두뇌 개발의 연구에 대한 생체내 모자이크에서 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다. 방법은뿐만 아니라 현재 프로젝트 6 타겟팅 높은 처리량 진을 통해 만들어지고있는 이들 사용할 수 있습니다 floxed 대립 형질을 활용합니다. Cre 호텔의 형질 표현의 사용에 비해이 방법은 floxed 대립 유전자를 가지고 생쥐가 실험에 직접 사용할 수있는 등, 다양한 셀 유형의 유전자 기능을 테스트하는 빠른 방법을 제공하고,에서 전체 바이러스 주입 절차는 완료 시작할 수 있습니다 한 시간 안에 달성. 또한, 감염된 세포의 수를 쉽게 개별 뉴런의 스파스 라벨을 수있는 바이러스의 titer를 변경하여 제어할 수 있습니다. 우리는 샘플 이미지의 연결 형태를 설명하지만, 감염된 뉴런의 분석은 분기와 기와,뿐만 아니라 척추 morphogenesis으로 시냅스 개발, axonal 및 돌기의 성장 등 많은 중요한 발달 과정에 확장하실 수 있습니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH (NINDS)에서 RO1 교부금에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| rAAV8 - Cre 호텔, - GFP, - DsRed, | 벡터 Biolabs | # 7060, # 7061, 맞춤 주문 | http://www.vectorbiolabs.com |
| 하버드 펌프 11 플러스 | 하버드 장치 | # 702208 | (발이 페달 포트) |
| 망막 안료 상피 주입 키트 | 세계 정밀 계측기 | RPE - KIT | 결합 튜브, 사출 바늘 (36G), 그리고 바늘 홀더 포함 |
| NanoFil 주사기, 100μl | 세계 정밀 계측기 | NANOFIL - 100 | 재사용 로딩 바늘 포함 |
| D - PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP 항체 | 에이브스 | GFP - 1020 | |
| DsRed 항체 | Clontech | 632496 | |
| 가열 블럭 | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R 마우스 | 잭슨 연구소 | 003309 |
참고문헌
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we goin....
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재인쇄 및 허가
