방법 논문

생물 학적 시스템에서 이온 농도의 측정을위한 형광 Nanoparticles

DOI:

10.3791/2896

⸱

2011년 7월 4일

 ,  , 
1Bioengineering Department, Northeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Northeastern University

이 논문에서

요약

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우리 실험실에서 생산되는 형광등 nanoparticles는 그러한 생리적 항상성 동안 신호 및 중간 유체 동안 세포와 같은 생물 학적 시스템에서 영상 이온 농도와 이온 fluxes에 사용됩니다.

초록

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몸 전체에 단단히 규제 이온 항상성은 탈수 같은 쇠약 상태의 방지를 위해 필요합니다. 대조적으로 1, 세포 수준에서 빠른 이온 fluxes가 고르기 세포 행동 잠재력을 시작 필요합니다. 2 나트륨 규정 모두에 중요한 역할을 이러한 경우는 있지만, 아무 방법은 현재 지속적으로 생체내 3 4 칼슘 프로브와 유사한 자세한 결과를 제공하지 않는 세포내 나트륨 프로브의 나트륨 수준을 모니터링 존재하지 않습니다. 이러한 공백을 모두 채우기 위해 노력의 일환으로, 형광등 nanosensors는 체외에서 생체내의 나트륨 농도를 모니터링 수있는 개발되었습니다. 5,6 이러한 센서들은 이온 - 선택적 optode 기술을 기반으로 및 나트륨 구체적인 인식 plasticized 고분자 입자로 구성되어 아르 요소, 산도에 민감한 fluorophores, 그리고 첨가제가 포함됩니다. 7-9은 Mechanistically, 나트륨 인식 요소는 센서에 나트륨의 압축을 풉니다. 10 추출 원인 센서 내에 충전 중립성을 유지하기 위해 수소 이온을 공개하는 산도에 민감한 형광단 원인 형광의 변화. 나트륨 센서도 높은 세포 농도의 칼륨을 통해 가역과 나트륨을위한 선택입니다. 6 그들은 직경이 약 120 나노미터이며,이 biocompatibility을 가르친다하기 위해 폴리에틸렌 글리콜로 코팅하고 있습니다. microinjection 기술을 사용하여 센서들은 심장 myocytes을 쳤습의 시간적 및 공간적 나트륨 역학을 모니터하는 표시된되었습니다 세포의 세포질로 전달할 수 있습니다. 주입했을 때 또한 11 일, 그들은 또한 생체내의 나트륨 농도에 실시간으로 변경 사항을 추적했습니다 subcutaneously 마우스로 3 본, 우리는 자세하게 설명하고 형광등 나트륨 nanosensors를 fabricating에 대한 방법론을 설명하고 간략하게 저희 연구소가에 대한 nanosensors를 사용하는 생물 학적 응용 프로그램을 보여줍니다 :. 세포로 센서의 microinjection을하며, 생쥐에 센서의 피하 주사 .

프로토콜

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1. optode의 준비

optode하기 전에, 구성 요소의 aliquots들은 쉽게 측정하고 저장할 수 있도록해야합니다.

  1. 50 MG 나트륨 Ionophore X (NaIX) 유리병과 50 MG 나트륨 tetrakis [3,5 - 비스 (trifluoromethyl) 페닐] borate은 (NaTFPB) 각 tetrahyrdofuran (THF)에서 자랐다 및 1.5 ML의 폴리스티렌 원심 튜브에 aliquoted 것입니다. 화학 퓸 배출 후드에서 배송 병​​에 THF 1 ML에 NaIX의 50 MG를 해산하고 고체가 완전히 해소되었는지 섞는다. 10 별도의 원심 분리기 튜브에이 솔루션을 100 μl을 전송합니다. NaTFPB에 대해 반복합니다. THF가 하룻밤 화학 퓸 후드에서 증발 원심 튜브를 라벨 및 저장 4도 냉장고에서 그들을 게재할 수 있습니다. 이것은 건조 NaIX 및 NaTFPB 5 MG의 aliquots을 만듭니다.
  2. THF 1 ML에 Chromoionophore III (진정해)을 디졸브와 3 ML의 유리관에 전송할 수 있습니다. 잔여 진정해를 해산하고 3 ML의 유리관에 이것을 추가하는 진정해 전달 약병에 THF의 다른 한 ML을 추가합니다. 지금이 ML 총있을 것입니다. 테플론 코팅 모자와 두 개의 1.5 ML 유리 튜브에 THF 솔루션에 진정해 1 ML을 전송합니다. 5 MG / ML의 최종 농도에서 4도 냉장고에 진정해 솔루션을 저장합니다.

이러한 aliquots 및 솔루션은 optode 자료를 만들기 위해 사용됩니다.

  1. 테플론 코팅 스크류 캡과 1.5 ML의 유리관에 BIS의 피펫 66 μl (2 - 에틸 헥 실)는 sebacate (DOS) - 이것은 optode 유리병이다. DOS는 점성 해결책 있도록 유리병에 전송 솔루션의 적절한 금액을 보장하기 위해주의 이동합니다. 볼륨 DOS의 ~ 60 MG에 해당합니다.
  2. 고분자량 폴리 (비닐) 염화 (PVC) 30 MG를 무게와 optode의 병을 이것을 전송할 수 있습니다.
  3. 이제 aliquoted 기능 구성 요소는 원하는 optode를 만들 optode의 약병에 추가할 수 있습니다. 진정해, NaIX 및 NaTFPB의 상대적 농도는 나트륨에 대한 센서의 응답을 결정합니다. 이러한 농도는 이상적으로 150 mm의 KD로, 10 MM, 또는 세포 농도의 KD과 농도를 세포에 대응 센서를 가지고 조정할 수 있습니다. 또한, 가능성이 센서의 공급 업체 및 교정에서 화학 물질의 배치 변화로 배치가 올바른 반응은 화학 성분이 각각의 새로운 배치에 대해 발생되었는지 확인하는 데 필요한있을 것입니다. 우리가 일반적으로 세포 내 나트륨 측정에 사용되는 농도와 센서를 만드는 방법을 설명합니다.
  4. 화학 퓸 배출 후드에서 optode의 약병에 THF 솔루션에 5 MG / ML 진정해 100 μl를 전송합니다.
  5. THF 300 μl에 NaIX 5 MG를 해산하고 NaIX 5 MG이 상호, optode의 약병 300 μl를 전송.
  6. THF 500 μl의 NaTFPB의 5 MG의 나누어지는를 해산하고 NaTFPB의 0.1 MG로 optode의 약병이 상호에 대한 솔루션을 20 μl를 전송합니다.
  7. optode의 약병에 THF 80 μl를 추가합니다.
  8. optode의 약병의 솔루션은 PVC, DOS 60 MG, NaIX, NaTFPB, THF 500 μl에 진정해 0.5 MG의 0.2 MG 5 MG 30 MG가 포함되어 있습니다. PVC의 모든 때까지 부드럽게 와동이 유리병은 해산했다. optode은 붉은 색해야합니다. THF 총 금액에 관계없이 사용되는 구성 요소의 비율은 500 μL되어야 유리병에 추가됩니다.
  9. NaIX 및 NaTFPB의 aliquots의 나머지 THF가 밤새 다시 레이블 튜브 화학의 정확한 양의를 증발 수 있습니다.

2. nanosensors 만들기

  1. 10 피펫 100 μl MG / ML 1,2 - Distearoyl - SN - Glycero - 3 - Phosphoethanolamine - N - 4 DRAM의 유리관에 클로로포름의 [메톡시 (Polyethyleneglycol) -550] (PEG - 지질). 클로로포름은 화학 퓸 후드에서 증발 수 있습니다. 이 과정은 질소 가스 또는 집 공기 솔루션을 건조하여 빠른하실 수 있습니다.
  2. PEG - 지질과 유리병에 원하는 수용액 4 ML을 추가합니다. sonicating 팁 아래 실험실 잭 병을 놓고 팁이 솔루션에 깊은 7mm 약 30 초 동안 낮은 sonication 전원에서 sonicate 때까지 병을 올립니다. 여기 ½ 인치 팁 직경 단계 호른과 함께 15 % 진폭로 설정 브랜슨 디지털 sonifier을 사용합니다. 수용액은 어떤 해결책이 될 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 trizma베이스 10 MM HEPES의 산도 7.2를 사용하는 센서의 응답을 확인합니다.
  3. 솔루션 sonicated되는 동안, 0.6 ML의 microcentrifuge 관의 dichloromethane 50 μl와 optode 소재의 50 μl를 섞는다. 심지어는 혼합하기 위해 피펫과 함께 섞는다.
  4. 3 분 sonicate에 sonifier 제어를 조정합니다. sonication을 시작하고 sonicating 동안 솔루션에 피펫 팁을 immersing하고 빠르고, 심지어 주사의 솔루션을 100 μl를 분배하여 유리병에 optode 혼합 솔루션을 추가합니다. 이 솔루션은 파랑, depe을 설정해야합니다사용된 수용액에 nding.
  5. sonication 그런 다음 약 30 초 동안 계속 sonicating 끝이 솔루션에 깊은 2mm 약 있도록 잭을 낮출 수. 이 솔루션을 공기에 쐬다 시작되어야하며 솔루션은 불투명하게 될 것입니다. 이 단계는 솔루션에서 잔여 THF과 dichloromethane을 제거하는 데 도움이됩니다.
  6. sonication가 완료되면, 5 ML의 주사기에 nanosensor 솔루션을 올려. 0.2 μm의 주사기 필터를 부착하고 나사 상단 뚜껑이있는 유리관에 nanosensor 솔루션을 분배. 미만 10 MM 나트륨을 포함, 9에 대한보다 산도를 가지고있는 수용액을 사용하는 경우 솔루션은 선명하고 푸른색해야합니다. 그렇지 않으면, 아무 색깔이 없다거나 핑크색해야합니다.

3. nanonsensor 응답을 결정

이 방법은 세포 내 나트륨을 측정하기위한 nanosensors의 반응을 결정하는 데 사용됩니다. 다른 농도는 세포 나트륨 농도 nanosensors을 위해 사용할 수 있도록 권장합니다.

  1. 10 MM HEPES (0 NA) 10 MM HEPES (1 M 나)와 산도 이러한 솔루션의 각 7.2 trizma베이스를 사용하여 1M 나트륨 염화물 (NaCl)의 주식 솔루션을 확인하십시오. 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 MM NaCl 농도 :와 솔루션을 만드는 50 ML 원뿔 원심 튜브에 0 나 1 M 나의 재고 솔루션을 섞는다.
  2. 응답을 결정하는 광학 하단에 96 자 번호판을 사용합니다. 칼럼 3 우물에 나트륨의 각 농도 100 μl를 추가합니다. 이것은 3 X 10 우물의 배열을 생성합니다.
  3. 각 물론 100 신선한 nanosensors의 μl과 microplate의 fluorometer에 부하를 추가합니다. 우리는 분자 장치 Spectramax M3를 사용합니다.
  4. 다음과 같은 파장 각 잘 읽어
여기 (NM) 방출 (NM) 컷 - 오프 (NM)
488 570 530
488 670 610
639 680 665

각 파장에서 nanosensor 강도는 나트륨 농도에 따라 좌우됩니다. 파장의 사용은 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 세포 느린 역학 측정, 우리는 488 nm/570 NM (여기 / 방출) 및 비율 두 파장을 우리에게 허용 및 소음을​​ 감소 488 nm/670 NM를 사용합니다.

  1. 전통적으로, optode 데이터는하는 가치로 변환 : α = (I - I 분) / (I 맥스 - I 분), 내가 주어진 나트륨 농도에서 농도가 어디, 나는 분 응답 측정에서 가장 낮은 강도입니다 , 그리고 최대의 응답 측정에서 가장 높은 강도입니다. 강도의 비율은 670 nm의에서 강도 또는 α에 680 nm의에서 강도로 나눈 570 nm의에서 중 변환합니다.
  2. -1 제로 나트륨 농도의 로그를 설정 나트륨 농도의 로그 비교 α를 계획하기 위해 Excel 또는 유래 일반적으로 우리가 실험실에서 사용되는 중, 음모를 꾸미고 소프트웨어를 사용합니다. 응답 sigmoidal 곡선을 맞습니다. 곡선에서 센서가 최적의 응답되는 농도를 나타냅니다 = 0.5 α의 나트륨 농도를 계산합니다.
  3. 관심의 나트륨 농도 주위에 최적의 응답 nanosensors을 만들 optode에 진정해, NaIX 및 NaTFPB의 비율을 조정합니다.

4. 세포 이미징

  1. 세포 측정, nanosensors는 물에 5 MG / ML 포도당으로 만들어집니다과 세포에 microinjected.
  2. 성장이나 유리 바닥 요리 또는 유리 coverslip 바닥과 이미징 챔버에 세포를 전송할 수 있습니다.
  3. 맑은 미디어 또는 Tyrode의 솔루션에있는 세포를 품어. epifluorescence 현미경에 이미지 챔버 또는 접시를 탑재합니다. 우리는 자이스 혈구 LSM 7 공촛점 현미경을 사용합니다.
  4. 피펫 풀러와 모세관 유리를 당겨. 우리는 300-500 nm의 주위에 마지막 팁 직경, 1mm OD, 0.78 mm ID를 유리와 함께 갈색 P - 97을 불타는 셔터를 사용합니다.
  5. Backfill nanosensor 주사기와 해밀턴 바늘을 사용하여 솔루션이나 microtip 로더와 피펫으로 피펫.
  6. micromanipulator에 연결된 및 압력 제어 분사 시스템에 연결된 소유자로 피펫를 탑재합니다. 여기 버레이 EXFO PC를 6000 micromanipulator 및 의료 장비 회사 주입기를 사용합니다.
  7. 세포의 상단에있는 피펫을 절감하고 세포질로, 때로는 은빛 멤브레인를 조작하는 사람 홀더 "탭"이 필요합니다. nanosensor 솔루션을 주사하고 신속하게 피펫을 철회.

5. 생체내 이미징에서

모든 절차는 노스 이스턴 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 검토와 승인되었습니다.

  1. Nanosensors생체내에 대해, 세포 이미징은 인산에 만들어진 것은 생리 버퍼와 135 mm의 나트륨 농도의 나트륨에 최적의 반응을 조정.
  2. 주사 설정과 생쥐의 형광 nanosensors의 이미징을위한, 우리는 IVIS 루미나 II와 관련 마취 장치를 사용합니다. 유도 및 이미징 방을 소독. 유도 챔버에 넣어 CD1 누드 쥐 (약 20g)과 isoflurane에 노출이. 투여 isoflurane과 산소 유량의 비율은 생쥐의 종류와 무게에 따라 다릅니다. 완전히 anesthetized 될 생쥐 기다립니다.
  3. 쥐가 anesthetized 후, 유도 챔버과 장소에서 이미징 챔버에 생쥐를 제거합니다. 마취에서 생쥐 보관하십시오. 각 마우스의 경우, 원하는 사출 영역을 소독.
  4. 모든 공기 방울을 제거해야하는 nanosensors 10 μL와 살균 31G 인슐린 주사기를 채우십시오.
  5. 포셉 사용하여 원하는 주사 사이트에서 마우스의 후면을 따라 피부의 작은 배를 파악. 피부를 쥐고 있지만, 최대 직면하고있는 베벨과 피부에 바늘 병렬로 피부에 주사기를 삽입합니다.
  6. 전에 센서를 주입하기 위해 바늘이 혈관에 삽입되지 않도록하기 위해 주사기의 플런저에 다시 가져옵니다. 그런 다음, 부드럽게 바늘 오른쪽으로 이동하여 피부 내에 주머니를 만들 수 떠났다. 이것은 센서가 주사 사이트의 밖으로 누출로 인해 다시 압력을 최소화합니다. 센서를 삽입하고 부드럽게 주사기를 제거합니다.
  7. 부드럽게 주사 사이트에 압력을 적용하고 사출 사이트의 유출됐다 수있는 솔루션을 닦아. 이것은 피부에 주입되지 않은 센서의 형광 최소화합니다.
  8. 원하는 사출 영역의 개수에 도달할 때까지 반복은 5.7을 통해 5.4 단계를 반복합니다. 골고루 뒷면의 왼쪽과 오른쪽에 간격 식스 사출 사이트는 것이 좋습니다. 바늘이 피부에 삽입하기 어려울 된 경우 각각의 마우스에 대한, 바늘을 변경합니다. 니들이 생쥐간에 공유되지 않습니다.이 생쥐간에 질병 전송 또는 교차 오염을 최소화합니다.
  9. 이미징 나트륨 형광등 센서, 우리가 가장 밀접 640 nm/680 NM (여기 / 발광) nanosensors의 스펙트럼과 일치하고 또한 피부의 autofluorescence을 최소화 필터 세트를 사용하여 마우스 브라이트와 형광 이미지를 모두 획득.

6. 대표 결과

figure-protocol-1
그림 1. 나트륨 다섯 가지 nanosensor 세트의 응답 곡선. 각 집합은 진정해, NaTFPB, PVC와 DOS의 같은 양의지만 NaIX의 다양한 양의했다 다른 optode 공법에서 nanosensors을 나타냅니다. 데이터는 680분의 639 나노미터 농도를 사용하여 α 값을 변환되었습니다. 데이터 오리진을 사용 장착되어 sigmoidal 곡선과 지혜로움에 대해 생략 3, 오차 막대의 평균입니다. 이 응답 곡선에서 사용되는 나트륨의 최대 농도 500 MM되었습니다. 나트륨에 대한 나트륨 nanosensors의 KD 10 MM (오렌지 다이아몬드)에서 약 150 MM (검은 사각형)로 원거리.

figure-protocol-2
그림 2. 신생아 심장 myocytes를 주입했다. 세포는 coverglass에서 교양 현미경에 장착 나트륨 nanosensors로 주입했다. 형광 (639 나노미터 여기), 브라이트, 그리고 오버레이 표시합니다. 일부 센서 클러스터링이 발생하지만 세포 센서는 cytosol에 걸쳐 확산하고 어떤 핵 로딩이없는 정상적인 형태를 갖고 있습니다.

figure-protocol-3
나트륨 nanosensors와 마우스의 그림 3. 피하 주사. 나트륨 nanosensors의 아홉 가지 주사는 누드 마우스의 피하 공간으로 만들어졌다. 명시야 및 형광 이미지 (680분의 640)이 겹쳐 둘.

토론

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optode 솔루션을 만든 후에는 nanosensors의 형성 10 분보다 더 오래 걸릴해서는 안와 PEG의 지질은 건조. Optode은 필요할 때 신속하게 만들 수 없다지만, 4도 섭씨에서 저장하면, 그들은 몇 달 동안 안정 수 있습니다. 우리는 nansensors 일단 형성은 적어도 일주일 용액에 안정 것으로 나타났습니다,. 그러나, 빛으로부터 nanosensors을 차단하여이 시간이 경과 photobleaching 방지하기 위해주의 이동합니다 6 나트륨 nanosensors 여기서 보여주는 동안, optodes가되었습니다 이러한 칼륨 및 염화물. 10,12 같은 대부분의 생물 학적 관련성이 높은 이온에 대해 우리는 또한 포도당과 같은 작은 분자로이 기술을 확장 만들었 13.

다른 analytes을 모니터 nanosensors를 생성하는 것 외에도,이 nanosensors은 대부분의 생물 학적 실험에 유용하게됩니다 다른 변경 사항에 대한 의무가 있습니다. 예를 들어, 표면 코팅,이 경우에는 폴리 (에틸렌 글리콜)는 쉽게 수용성되는 amphiphilic 분자를 사용하여 변경할 수 있습니다. 이것은 다른 응용 프로그램이나 타겟에 대해 이러한 nanoparticles를 functionalizing의 가능성을 수 있습니다. nanoparticles의 크기는 표면 코팅, sonication 강도 또는 용매가 사용을 변경하여 조정할 수 있습니다.

칼슘 형광 표시기는 세포내 칼슘 신호를 결정하는 귀중한되었습니다, 그러나, 가능 나트륨에 민감한 염료 같은 이상적인 특성이 없습니다. Optode는 이미징 이온이 intracellularly 년 동안 개발되었습니다위한 대체 방법을 제공하기위한 nanoparticles. 14 우리는 희망 나트륨 신호가 세포 기능과 영향을 미치는 방법을 이해하기위한 수단을 제공합니다 세포내 나트륨 이미징 특정 nanosensors을 만드는이 이전의 연구에 구축 특정 질병으로 이어질 신호로 변경.

생체내에 형광 nanosensors의 사용은 혈액이 그립 3. 나트륨과 위의 기술을 기반으로 포도당 nanosensors가 각각에서 나트륨과 포도당의 변화를 추적하기 위해 표시되었습니다와 같은 다른 방법을 통해 모니터링 analytes에 대한 최소한 - 침략 대안 실시간 제공 생체내. 3,13 그러나, 현재 모니터링 도구로이 방법에 제한이 존재한다. 예를 들어, 센서가 충분히 피부의 배경 autofluorescence을 최소화하기 위해 인치 15 번째 가까운 적외선 빨간색쪽으로 이동 스펙트럼과 형광단을 포함해야합니다, 현재 분사 기술 등으로 인해 발생할 수 있습니다 nanosensors의 균일한 분사를 생성하지 않습니다 주입 농도의 변화와 같이 오류. 이러한 제한에도 불구하고, 이러한 형광 nanosensors과 성공적인 시연의 개발은 환자의 건강을 모니터링 이러한 센서는 귀중한 연구 도구 및 방법을 만들 수 있습니다.

공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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JMD와 MKB은 노스 이스턴 대학 (NCI와 NSF 그랜트 DGE - 0504331에서 자금)에서 IGERT의 Nanomedicine 과학 기술 프로그램을 통해 자금 지원을 받고 있습니다. 이 작품은 또한 일반적인 메디컬 사이언스 부여 R01 GM084366 보건 국립 연구소 국립 연구소에 의해 투자되었다. 우리는 또한 동물 프로토콜 개발에 자신의 기여에 대한 심장 myocytes 케빈 캐시를 제공 Saumya 다스과 보스턴의 BIDMC의 안소니 로즌즈바이그 감사합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
제품 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
IVIS 루미나 II 악기 패키지 캘리퍼스 생명 과학 126273
CD - 1 누드 쥐 찰스 강 스트레인 코드 : 086 Immunodeficient
인슐린 주사기 BD 328438 10분의 3 CC ML, 8mm, 31G
고분자량 PVC 시그마
DOS 시그마
진정해 시그마
NaTFPB 시그마
NaIX 시그마
얇은 벽으로 둘러싸인 모세관 유리 서터
PEG의 지질 아반티 폴라 Lipids

표 1.이 절차에서 사용되는 화학 물질 및 장비의 목록을 제공합니다. 목록에없는 모든 일반적인 화학 물질은 시그마에서 구입한했다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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