kisspeptin 수용체 (KISS1R)에 돌연변이가 환자의 생식 장애와 관련된 있습니다. 여기 immunoprecipitation과 서양 얼룩에 의한 수용체의 저하 경로를 특성화 KISS1R의 GC 풍부한 순서뿐만 아니라 KISS1R 구조의 사용으로 관심 변이를 소개하는 방법을 설명합니다
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방법 논문
생식기 장애와 인간에서 확인된 GC 풍부한 KISS1 수용체 유전자 시퀀스에 돌연변이 돌연변이 유발 및 분석
이 논문에서
요약
초록
kisspeptin 수용체 (KISS1R)는 사춘기의 트리거와 성인 1,2,3의 생식 능력의 레귤레이터로 인식 G 단백질 결합 수용체이다. 환자에서 확인된 KISS1R의 운영을 중지시키지 변이는 iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2와 조숙한 사춘기 4 연결되어있다. 이러한 돌연변이의 기능 연구는이 수용체에 의해 복제의 규제뿐만 아니라를 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해에 대한 중요한 질병 결과를 형성 사람, 비정상적인 KISS1R 신호와 함수에서 어떤 결과를. 그러나, KISS1R 유전자의 높은 GC 풍부한 시퀀스는 다소 어려운 변이를 소개하거나 PCR하여이 수용체를 인코딩 유전자를 증폭 수 있습니다.
여기 우리 연구실에서 십여 KISS1R의 돌연변이를 통해 생성 성공적으로 사용되고 있습니다이 높은 GC 풍부한 순서에 관심이 변이를 도입하는 방법을 설명합니다. 우리는 대체, 삭제 또는 KISS1R 시퀀스의 삽입을 포함 KISS1R의 돌연변이의 범위의 증폭을 촉진하기 위하여 PCR 조건을 최적화합니다. PCR 향상제 솔루션 또한뿐만 DMSO의 작은 비율로 증폭을 개선하기 위해 특히 도움이되었습니다. 이 최적화된 절차뿐만 아니라 다른 GC 풍부한 템플릿을 유용할 수 있습니다.
KISS1R 인코딩 발현 벡터는 변이가 KISS1R 기능을 변경하고 관련된 생식 phenotypes가 발생할 수 있습니다 방법을 이해하기 위해서는이 수용체의 신호와 기능을 특성화하는 데 사용되고있다. 따라서, 사이트 감독 돌연변이 유발에 의해 생성된 KISS1R의 돌연변이의 가능성이 응용 프로그램은 많은 연구에 의해 그림 1,4,5,6,7,8 수 있습니다. 예를 들어, 조숙한 사춘기와 관련된 KISS1R (Arg386Pro),에있는 이득의 기능 변이는 KISS1R 9 저하의 속도를 변경하는 리간드 자극 사뿐만 아니라 수용체의 반응을 연장하기 위해 표시되었습니다 . 흥미롭게도, 우리의 연구는 대부분의 G 단백질 결합 수용체 9 설명한 고전 lysosomal 저하에 반대하는, KISS1R은 proteasome에 의해 저하되고있는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 예제에서 KISS1R의 저하는 transiently Myc - 태그 KISS1R (MycKISS1R)를 표현하는 인간의 배아 신장 세포 (HEK - 293)에서 조사하고 proteasome 억제제 또는 lysosome과 치료. 세포 lysates은 서양 얼룩 분석 뒤에 아가로 오스 - 복합 백신 myc 항체를 사용하여 immunoprecipitated 있습니다. blots에 대한 감지 및 MycKISS1R의 부량는 LI - COR 오딧세이 적외선 시스템을 사용하여 수행됩니다. 이러한 접근 방식뿐만 아니라 관심의 다른 단백질의 저하의 연구에 유용하게 사용될 수 있습니다.
프로토콜
1. 높은 GC 풍부한 KISS1R 유전자 시퀀스의 사이트 이동 돌연변이 유발
- 템플릿 : 자사의 N - 말단에 융합 Myc 태그와 인간 KISS1R의 전체 cDNA 시퀀스. 이 순서는 이후 transfections에 사용되는 포유 동물 세포 라인과 호환되는 pCS2 + 발현 벡터로 복제됩니다. 이 발현 벡터는 pCS2 + Myc KISS1R로 여기라고합니다.
- 뇌관 디자인 : primers이 Quikchange 사이트 감독 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)의 지시에 따라, 원하는 돌연변이 들고하도록 설계되었습니다. 요약 :
- 모두 (순방향 및 역방향) primers 원하는 변이를 포함하여 플라스미드의 반대 가닥에서 동일한 순서로 어닐링해야합니다 (예 : 순방향 및 역방향 primers 서로 보완)
- Primers는 하나 이상의 C 또는 G 기지에서 25-45 기지 긴 주말이 될
- 모두 (순방향 및 역방향) primers 원하는 변이를 포함하여 플라스미드의 반대 가닥에서 동일한 순서로 어닐링해야합니다 (예 : 순방향 및 역방향 primers 서로 보완)
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토론
사이트 이동 돌연변이 유발이 세 수십 년 동안 타겟 유전자의 코딩 순서 염기 변화를 도입하여 단백질 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 원래 기술은 영국 - 캐나다 케미과 노벨상 수상자 마이클 스미스 10 1978 설명했다. 마이클 스미스는 카리 뮬리스, 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR) 11를 발명한 미국의 생화학과 화학의 1993 노벨상을 공유했습니다. 마이클 스미스가 설명한 원래 메소드는 지난 몇 년 동안 개선되었습니다. 한 PCR 반응에서 원하는 유전자 서열에 돌연변이, 삽입 또는 삭제를 소개하는 능력은 높은 정확성과 성공 요금이 절차의뿐만 아니라 시간의 비교적 짧은 기간에 돌연변이의 생산에 기여하고 있습니다.
같은 KISS1R 같은 높은 GC 풍부한 유전자 시퀀스의 모든 기술 향상, 변이 및 증폭에도 불구하고 특히 골칫거리입니다. 높은 GC 함량 시퀀스의 돌연변이 유발을위한 primers의 크기는 용융 온도가 권.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
그리고 찰스 H. 후드 재단 영 인베스티게이터 아동 건강 연구 수상 (보스톤, MA)에 의해 -이 작품은 부분적으로 아동 보건 인간 발달의 국립 연구소 (R21 HD059015 NICHD)의 생식 도서관에 의해 투자되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 10X PCRx 향상제 솔루션 | Invitrogen | 52,391 | |
| PfuUltra 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 대체 세제 | Stratagene | 600385 | |
| Dpn - I | 뉴 잉글랜드 Biolabs | R0176 | |
| XL10 - 골드 Ultracompetent E. 대장균 세포 | Stratagene | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 - CV | |
| 태아 소 혈청 | 애틀랜타 체액 | S11550 | |
| Geneporter의 Transfection 시약 | Genlantis | T201007 | |
| 류펩틴 | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47,491 | |
| 10xPBS | 앰비온 | AM9625 | |
| 단백 분해 효소 저해제 칵테일과 PMSF | 산타크루즈 생명 공학 | SC - 24948 | |
| 피어스 BCA 단백질 분석 키트 | 써모 과학 | 23,225 | |
| 안티 Myc 태그 (클론 4A6) 아가로 오스 공액 | Millipore | 16-219 | |
| 2X 로딩 버퍼 | BioRad | 161-0737 | |
| 기준 트리스 - HCL 프리 캐스트 젤, 4-15% 기울기 | BioRad | 345-0028 | |
| Immobilon - FL PVDF 막 | Millipore | IPFL00010 | |
| 오딧세이 차단 버퍼 | LI - COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 | |
| 토끼 안티 - myc 항체 | 세포 신호 | 2272 | |
| 염소 항 토끼 IRDye 800CW | LI - COR Biosciences | 926-32211 | |
| 오딧세이 이미징 적외선 시스템 | LI - COR Biosciences | ||
| 할트 프로 테아제 억제제 칵테일 (100x) | 써모 과학 | 78,430 |
참고문헌
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. ....
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재인쇄 및 허가
